貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抗腫瘤作用及急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

吳建軍，張延英，張書(shū)楠，李金娟，慕婷婷，裴凌云，趙 翊

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000)

酪蛋白 (casein)是牛奶中的主要組成成分，它是一組蛋白的磷酸鹽，由4種成分組成:αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白［1］。貞芪酪蛋白肽 (ligustri-astragali casein co-peptid，LACP)是根據(jù)“扶正培本、扶正祛邪”的理論，將黃芪、女貞子按一定比例通過(guò)水提醇沉法干燥以后再與酪蛋白復(fù)合肽按一定比例混合而成［2］。為探討其對(duì)實(shí)體瘤生長(zhǎng)抑制作用及機(jī)制和安全性，進(jìn)行了本次研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 將Lewis肺癌細(xì)胞置于含10%胎牛血清及RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液備用。Lewis肺癌細(xì)胞由蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所提供。

1.2 荷瘤小鼠模型的制作及毒性試驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)8周齡C57小鼠72只，雌性，體質(zhì)量18～22 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供 (實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001)。選用培養(yǎng)的Lewis肺癌細(xì)胞按106個(gè)/mL制成細(xì)胞懸液，在各組小鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2 mL懸液。急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)小鼠由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，昆明種小鼠100只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水喂養(yǎng)12 h，室溫18～22℃，相對(duì)濕度50%～70%。

1.3 藥品及試劑 貞芪酪蛋白為以黃芪、女貞子按一定比例按水提醇沉法干燥以后再與酪蛋白復(fù)合肽按一定比例混合而成，酪蛋白由蘭州同健生物醫(yī)藥公司提供，批號(hào)090211。小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司，RPMI-1640培養(yǎng)基干粉為Gibco公司產(chǎn)品，胰蛋白酶由美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，Iα抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其他試劑采用國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 LACP復(fù)合物體內(nèi)抗腫瘤研究的分組及處理 將72只小鼠除隨機(jī)抽取12只作為陰性對(duì)照組之外，其余小鼠Lewis細(xì)胞接種后24 h隨機(jī)分為5組，分別為模型組，貞芪酪蛋白肽復(fù)合物1.5、2.1、3.5 g/kg 3個(gè)劑量組，陽(yáng)性藥物采用金復(fù)康口服液 (江中集團(tuán)一村制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)101208);每日2次，連續(xù)灌胃給藥后第11天麻醉小鼠脫頸處死。生理鹽水進(jìn)行腹腔灌洗，輕柔腹腔2 min后，解剖小鼠抽取灌洗液稀釋細(xì)胞，單核細(xì)胞分離液分離的單核細(xì)胞，調(diào)整密度至106個(gè)/mL，以FITC標(biāo)記的Iα單抗 (Sigma公司)標(biāo)記細(xì)胞，洗滌后流式細(xì)胞儀檢測(cè)單核細(xì)胞Iα分子表達(dá)活性 (以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例表示)。另外，取不同劑量組給藥的小鼠右腋窩皮下新鮮腫瘤組織制備單細(xì)胞懸液于試管中。靜止10 min，吸取上層混濁液。上層混濁液2000 r/min離心5 min，倒去上清。PBS洗滌，制成單細(xì)胞懸液，PI染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.2 急性毒性及最大耐受量的測(cè)定

2.2.1 LACP復(fù)合物L(fēng)D50測(cè)定 取SPF級(jí)昆明種小鼠60只，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表分為4組 (空白組和不同給藥劑量的受試藥物組)，每組15只。給藥劑量為2.0、1.0和0.5 g/kg。按0.20 mL/10 g分別對(duì)各受試藥物組小鼠進(jìn)行灌胃給藥，空白組灌胃給予等體積的生理鹽水。24 h內(nèi)給藥3次，觀察記錄小鼠毛色、自主活動(dòng)、呼吸、飲食、大小便等一般情況、中毒表現(xiàn)及死亡情況，共14 d。

2.2.2 LACP復(fù)合物最大耐受量 (MTD)的測(cè)定 取SPF級(jí)昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為2組 (空白組和受試藥物組)，每組20只。受試藥物最大質(zhì)量濃度200 mg/mL貞芪酪蛋白按0.4 mL/10 g灌胃給藥，空白組灌胃給予等體積的生理鹽水。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 LACP復(fù)合物對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞周期的影響 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物作用肺癌實(shí)體瘤細(xì)胞，高、中劑量組可見(jiàn)G1期細(xì)胞明顯增多，分別達(dá)到78.1%和64.4%，G2期細(xì)胞減少為4.77%和0.439%，S期分別為17.1%和35.1%，提示細(xì)胞發(fā)生明顯的G1/G2期阻滯。見(jiàn)圖1。

圖1 芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞周期的影響

3.2 LACP復(fù)合物對(duì)免疫細(xì)胞Mφ表面Iα抗原表達(dá)的影響

貞芪酪蛋白肽復(fù)合物能夠促進(jìn)小鼠Mφ細(xì)胞系統(tǒng)類(lèi)Iα抗原表達(dá)，顯示貞芪酪蛋白肽復(fù)合物可以提高小鼠免疫功能，見(jiàn)表1。

表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠Mφ表面Iα抗原表達(dá)陽(yáng)性率的影響 (，n=10)

表1 貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物對(duì)小鼠Mφ表面Iα抗原表達(dá)陽(yáng)性率的影響 (，n=10)

注:與模型組比較，▲P＜005，▲▲P＜001

組別 劑量/(g·kg －1)Iα抗原表達(dá)的陽(yáng)性率/%36.7±4.1模型組 生理鹽水 37.2±3.9金?？悼诜航M 0.1 mL/g 49.9±3.9▲貞芪酪蛋白復(fù)合肽低劑量組 1.5 39.1±3.6貞芪酪蛋白復(fù)合肽中劑量組 2.1 50.3±4.2▲貞芪酪蛋白復(fù)合肽高劑量組 3.5 56.0±4.5陰性對(duì)照組 生理鹽水▲

3.3 LACP復(fù)合物L(fēng)D50測(cè)定結(jié)果 給藥后連續(xù)觀察7 d，記錄動(dòng)物死亡、體質(zhì)量變化和毒性反應(yīng)情況，結(jié)果無(wú)一只動(dòng)物死亡，因受試藥物濃度和體積限制，無(wú)法測(cè)出受試藥物的LD50(見(jiàn)表2)，故進(jìn)行MTD測(cè)定。

表2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 (n=15)

3.4 LACP復(fù)合物MTD測(cè)定結(jié)果 給藥后連續(xù)觀察10 d，初步測(cè)得MTD值為8 g/kg，記錄小鼠中毒癥狀和死亡情況。觀察結(jié)果為小鼠活動(dòng)自如，皮毛整潔、有光澤，鼻、眼、口腔未見(jiàn)異常分泌物，進(jìn)食、排泄物及呼吸狀況等均正常，受試動(dòng)物無(wú)一只死亡。第10天處死全部小鼠，解剖并觀察各鼠主要臟器 (心、肝、脾、肺、腎)，未見(jiàn)任何異常改變。小鼠體質(zhì)量變化觀察結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，受試藥物組小鼠體質(zhì)量增加無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 MTD測(cè)定在觀察期限內(nèi)體質(zhì)量的變化 (，n=20)

表3 MTD測(cè)定在觀察期限內(nèi)體質(zhì)量的變化 (，n=20)

注:所有組不同時(shí)間與空白組比較，P＞0.05

給藥后體質(zhì)量1 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 9 d 10 d空白組 0.4mL/10g 19.2±1.919.8±2.118.5±1.720.1±2.221.5±2.623.2±2.623.8±2.524.8±3.125.6±組別 劑量 開(kāi)始體質(zhì)量2.7 28.2±3.2受試組 100 mg/mL 19.8±1.720.5±1.919.2±1.921.4±2.122.5±2.623.9±2.624.1±2.725.6±2.928.2±3.2 29.0±3.9

4 討論

貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)作用在前期的研究中已經(jīng)作了論述，其灌胃給藥可有效抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)，其抗腫瘤作用機(jī)制可能與改善荷瘤鼠免疫功能等有關(guān)［3］。多數(shù)蛋白質(zhì)都存在具有生物活性的多肽序列，酶解蛋白質(zhì)可以釋放生物活性多肽［4］。牛乳中酪蛋白中蘊(yùn)藏著許多生物活性肽，包括阿片活性肽、抗高血壓肽、免疫調(diào)節(jié)肽、抗血栓肽、結(jié)合礦物元素的活性肽、抗菌肽等［5-8］。隨著活性肽的研究深入和酶工程技術(shù)應(yīng)用，促進(jìn)了人們對(duì)活性肽物質(zhì)的興趣，推進(jìn)了多肽產(chǎn)品如肽類(lèi)藥物、肽類(lèi)試劑、化妝品等開(kāi)發(fā)研究［9-12］。目前，日本以及歐美等國(guó)家已上市的大量的活性肽功能性食品或食品添加劑，主要用于調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)康復(fù)，預(yù)防疾病發(fā)生等。酪蛋白復(fù)合多肽同傳統(tǒng)中藥嫁接將極大地豐富完善各自藥理作用，前期課題組的研究進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論［3，13-15］，本研究根據(jù)“扶正培本、祛邪”理論將黃芪、女貞子與酪蛋白按一定比例配制而成并探索了其抗腫瘤作用及機(jī)制。非已抗原 (如細(xì)菌等)以非特異性方式與巨噬細(xì)胞結(jié)合，后者借助吞噬、胞飲、吸附或FcR、CR介導(dǎo)的調(diào)理作用攝取抗原。巨噬細(xì)胞的抗原提呈功能與細(xì)胞表面的細(xì)胞因子Iα等表達(dá)密切相關(guān)，所以巨噬細(xì)胞表面Iα的表達(dá)被認(rèn)為是代表機(jī)體免疫功能的重要標(biāo)志之一。本研究應(yīng)用FITC標(biāo)記的Iα單抗借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示LACP能提高巨噬細(xì)胞表面Iα抗原表達(dá)，可能進(jìn)一步揭示LACP抗腫瘤與調(diào)節(jié)荷瘤小鼠免疫功能有關(guān)。大多數(shù)抗腫瘤藥物主要作用之一與抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)，阻滯腫瘤細(xì)胞從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，本研究顯示LACP阻滯腫瘤細(xì)胞于G1/G2期。

本實(shí)驗(yàn)未測(cè)出貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物的LD50表明貞芪酪蛋白多肽復(fù)合物的毒性極低;小鼠灌胃給藥的MTD為8g/kg(相當(dāng)于臨床成人擬用藥量300倍)，在該劑量下未見(jiàn)小鼠發(fā)生任何毒性反應(yīng)，處死小鼠解剖后觀察其主要臟器未見(jiàn)任何異常，顯示了LACP復(fù)合物的低毒和安全性，為L(zhǎng)ACP保健品開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

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