去氫駱駝蓬堿通過誘導凋亡發(fā)揮抗腫瘤藥理作用研究進展

顧 帆，顧月清

(中國藥科大學，江蘇南京 210009)

駱駝蓬Peganum harmala L.是多年生草本蒺藜科駱駝蓬屬植物，是我國維族、蒙古族常用藥材，被列入衛(wèi)生部藥品標準維吾爾族分冊。主要分布于我國西北地區(qū)，在中東、中亞、地中海沿岸、南美也有分布。駱駝蓬性平，味苦、辛，有毒，具有堅固筋脈、助陽暖陰、消散寒濕氣等功能，主治筋脈軟弱、骨關節(jié)痛、咳嗽痰多、偏癱健忘、神昏頭痛、月經(jīng)不調等癥［1］。種子和全草均具有藥用價值，其主要活性成分有去氫駱駝蓬堿 (harmine)、駱駝蓬堿 (harmaline)和去甲駱駝蓬堿 (harmalol)等。

去氫駱駝蓬堿 (7-甲氧基-1-甲基-9H-吡啶并［3，4-b］吲哚，harmine)，又稱肉葉云香堿，淡黃色針狀晶體，分子量為212.25，分子式為Cl3H12N20，是一種三環(huán)β-咔啉類生物堿，結構式如圖一所示。harmine在自然界中分布廣泛，包括各種植物、海洋生物、昆蟲等，最早于1874年被人們從植物Peganum harmala的種子中提取得到。它在駱駝蓬種子中的含量較高，結構穩(wěn)定。研究表明，harmine具有抗菌、抗瘧原蟲、抗真菌、抗氧化、抗腫瘤、抗誘變、細胞毒、致幻等一系列藥理作用［2］。

圖1 去氫駱駝蓬堿的結構

1 Harmine的抗腫瘤作用

隨著對harmine單體化合物藥理作用研究的進一步深入，越來越多的實驗證實該化合物對多種腫瘤模型具有明確的抑制作用。

體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，harmine對宮頸癌細胞HeLa、S-180、胃癌細胞 MGC-803和 HGC27、肝癌細胞 BEL-7402、鼻咽癌細胞CNE-2、人胰腺癌細胞AsPC-1、白血病細胞K562、小鼠結腸癌細胞Colon26等多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用［3］。Jahaniani等采用MTT法檢測 harmine的抗癌活性，發(fā)現(xiàn)其對人類腫瘤細胞 (HL60，K562，HeLa，KB，A549，Saos-2，A2780-CP，A2780-S，MCF-7，A375，A172等)具有廣泛的細胞毒性［4］。

Liu等研究表明，harmine鹽酸鹽能夠顯著阻礙初級及次級神經(jīng)球形成，誘導神經(jīng)膠質瘤細胞GSLCs分化，并降低GSLCs的干性，發(fā)揮抗膠質瘤作用［5］。而在Zhang等的研究中，harmine表現(xiàn)出對胃癌細胞遷移與侵襲的抑制效果［6］。

體內抗腫瘤研究結果表明，harmine對S-180小鼠、網(wǎng)織細胞肉瘤L2和小鼠肝癌都有顯著的療［7］;可通過抑制血管形成，抑制裸鼠的肺癌細胞A549細胞異種移植瘤［8］;對大鼠體內接種的膠質母細胞瘤也有較好的生長抑制效果［6］。

另外，harmine與順鉑、阿霉素聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤效果［9］。與米托蒽醌、喜樹堿等聯(lián)用，能夠通過減少細胞BCRP(乳腺癌耐藥蛋白)依賴的外排作用，大幅度降低它們對BRCP高表達細胞的半數(shù)抑制率 (IC50)，恢復其對抗癌藥物的敏感性［10］。

2 Harmine誘導腫瘤細胞凋亡的作用

細胞凋亡 (apoptosis)是細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)的一種形式，即在一定生理病理條件下，機體通過基因水平的調控，使細胞主動死亡以維護內環(huán)境穩(wěn)定的過程，于1972年由Kerr等根據(jù)形態(tài)學特征首次提出［11］。

2.1 Harmine誘導腫瘤細胞凋亡的檢測方法 隨著技術的進步，新的細胞凋亡檢測方法不斷涌現(xiàn)，對于凋亡細胞的檢測趨近快速而準確。大量研究通過多種檢測手段，例如形態(tài)學觀察、電泳法、原位末端轉移酶標記法、流式細胞技術等，確證了harmine能夠通過誘導細胞凋亡的方式發(fā)揮抗腫瘤效果。

2.1.1 形態(tài)學觀察 凋亡細胞的形態(tài)變化包含以下幾個方面的特征:細胞體積變小，細胞質濃縮，核染色質固縮于核膜邊緣，DNA降解，多個凋亡小體形成，并被周圍細胞吞噬消化［12-13］。劉俊玲等研究發(fā)現(xiàn)，harmine作用Jurkat細胞48 h后細胞后，進行Wright-Giemsa染色，觀察形態(tài)發(fā)生了明顯改變，染色質分布不均，呈致密濃染的塊狀，核膜增厚，核固縮碎裂，細胞形態(tài)基本完整。而未加藥物組細胞體積大，外形較規(guī)則，核呈圓形或橢圓形，核染色質疏松細致，呈藍紫色，核仁大而清晰，胞漿豐富［14］。李強等使用Hoechst 33258染色可見，harmine作用后的HepG-2發(fā)生細胞核固縮邊聚裂解，凋亡小體形成等凋亡形態(tài)學變化［9］。Hamsa等以蘇木精、署紅染色B16F-10細胞后觀察，細胞膜起泡、染色質濃縮、DNA碎裂，同樣有凋亡小體出現(xiàn)［15］。

2.1.2 電泳法 凋亡發(fā)生時Ca2+和Mg2+水平升高可激活細胞內核酸內切酶，導致細胞核DNA雙鏈斷裂，形成180～200 bp的整數(shù)倍的寡核苷酸片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以觀察到典型的梯型條帶。利用這種現(xiàn)象，DNA梯形條帶法至今仍作為最可靠的凋亡檢測手段被廣泛應用［16］。研究人員從 harmine作用的 HepG-2、B16F-10、SGC-7901、Jurkat、U937、HL-60等細胞中抽提得到DNA，電泳后均呈現(xiàn)不連續(xù)DNA的梯狀連續(xù)條帶，表明片段化的形成，證實了 harmine 誘導凋亡的發(fā)生［15，17-19］。

單細胞凝膠電泳 (Single cell gel electrophoresis)又稱彗星實驗 (Comet assay)。細胞經(jīng)裂解后，受損的DNA能在堿性電泳液作用下解旋后產生DNA斷片，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)彗星影像。反之，未受損傷的DNA，染色后呈圓形斑點無拖尾現(xiàn)象。Boeira等采用彗星實驗考察了harmine誘導V79細胞凋亡的作用，與對照組相比，harmine在所有濃度下均表現(xiàn)出凋亡特有的DNA損傷指數(shù)以及損傷頻率顯著提升的趨勢［20-21］。

2.1.3 原位末端轉移酶標記法 原位末端轉移酶標記法(TUNEL assay，Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay)的原理是利用凋亡細胞的DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現(xiàn)缺口，產生一系列3'-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶 (TdT)作用下，將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標記到DNA的3'末端，從而進行凋亡細胞的檢測。相反，正常細胞因為幾乎沒有DNA斷裂缺口，所以不產生3'-OH，無法被染色［16］。Hamsa等利用TUNEL法檢測harmine給藥后B16F-10細胞的生長情況，觀察到大量TUNEL陽性細胞 (判定為凋亡細胞)，并通過觀察進一步確認了凋亡導致的細胞核濃縮現(xiàn)象［15］。

2.1.4 流式細胞技術 流式細胞技術可以作為定性和定量檢測細胞凋亡的方法，具有操作簡單、快速和敏感度高等優(yōu)點，該法的基本原理是細胞在通過流式細胞儀激光焦點時可以發(fā)生光散射，產生前向散射光 (FSC)和側向散射光 (SSC)，前者強度與細胞大小有關，后者強度與質膜和細胞內部的折射率有關。凋亡細胞的FSC減小，而SSC增大;壞死的細胞FSC和SSC都會增大;而正常細胞FSC增大，SSC減小。因此，通過對散射光的分析，可以對三種細胞進行檢測和區(qū)分［16］。李強等用Annexin V-PI雙染法檢測HepG-2細胞早期凋亡率，加藥組細胞出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，隨著harmine濃度的增大，HepG-2細胞的亞二倍體百分率增加，表明harmine可能是通過啟動凋亡途徑抑制腫瘤細胞的增殖的。而僅用PI染色的HepG-2細胞，通過流式細胞儀檢測細胞周期，結果顯示S期及G2/M期數(shù)量提升，同時G0/G1期數(shù)量下降，即harmine對細胞周期產生G2/M期阻滯效果［17］。宋震亞等用harmine作用于SGC-7901細胞后進行PI染色，通過流式細胞儀測得細胞周期的G1期前亞二倍體的凋亡峰均顯著增強，顯示harmine對SGC-7901細胞具有明顯的促進凋亡作用［18］。張曉凱等將harmine作用于胰腺癌AsPC-1細胞，經(jīng)Annexin V-FITC/PI雙染后由流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，各組給藥細胞的晚期凋亡及壞死細胞群均顯著增多［22］。

2.2 Harmine誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制 harmine誘導細胞凋亡的作用機制雖然尚未得到完整確切的闡明，但harmine對參與細胞凋亡的一系列重要調控分子 (如caspase、bcl-2、p53、PARP等)所產生的作用受到了研究者們的廣泛關注。

2.2.1 Caspase與凋亡信號轉導通路 細胞凋亡的信號轉導至少存在內、外源性兩條途徑。內源性途徑中，線粒體受到細胞內外傳來刺激，釋放細胞色素C并與Apaf-1形成多聚體，繼而連續(xù)激活caspase-9以及caspase-3，啟動凋亡級聯(lián)反應。外源性途徑包括TNFR途徑與Fas/FasL途徑，分別經(jīng)由caspase-8與FADD的激活，啟動下游的caspase相關蛋白酶活化反應［24］?？梢奵aspase家族蛋白，尤其是caspase-3和caspase-8，在腫瘤細胞凋亡信號轉導通路的各個階段廣泛發(fā)揮著不可替代的作用［23-24］。Cao等采用Western-Bloting法考察了harmine作用HepG-2細胞后的蛋白表達情況，可以觀察到caspase-3和caspase-9的前體裂解與活化［17］。張曉凱等發(fā)現(xiàn)在AsPC-1細胞中caspase-3的表達也能被harmine抑制［22］。而采用RT-PCR考察mRNA基因表達分析顯示，harmine作用后的 B16F-10后，caspase-3、caspase-8和caspase-9的表達在給藥后短時間內即顯著提升［15］。上述結果表明harmine對內、外源性的細胞凋亡通路上caspase分子都能產生作用，并且可能是凋亡機制的啟動誘導因素。

2.2.2 bcl-2基因 bcl-2家族分為抗凋亡基因 (bcl-2、bcl-xL、Mcl-1等)和促凋亡基因 (Bax、Bid等)兩類。它們調節(jié)線粒體PT孔的開放與閉合，從而控制線粒體跨膜電位的變化，在凋亡途徑中發(fā)揮至關重要作用［25-26］。研究表明，harmine作用于白血病細胞U937、HL-60、Jurket細胞后，隨藥物濃度的增大bcl-2蛋白的表達量降低，提示Bcl-2在harmine誘導白血病細胞凋亡的信號途徑中是重要的調控因子［19］。bcl-2與Bax蛋白量的比率決定異二聚體(bcl-2/Bax)與同二聚體 (Bax/Bax)的比值，這對決定細胞凋亡的易感性起關鍵作用，是啟動細胞凋亡的“分子開關”［27-28］。harmine作用胃癌細胞 BGC-823以及 SGC-7901后，bcl-2表達量降低，而 Bax表達量提高。作用肝癌HepG-2細胞后，bcl-2、Mcl-1和bcl-xL的表達量降低，而不影響B(tài)ax，這些情況都導致bcl-2/Bax、Mcl-1/Bax與bclxL/Bax的比值降低［7，17］。因此對 bcl-2家族的影響，既是harmine誘導凋亡效果的重要證據(jù)，也可能是主要的機制之一。

2.2.3 p53基因 p53是一個參與細胞應激反應的核轉錄因子，能對包括DNA損傷與癌基因激活等刺激做出反應。當這些刺激激活p53后，活化的p53激活其靶基因p21、p27、Bax和Bid等，增加細胞色素C的釋放，導致caspase-9激活，然后切割效應caspase(如caspase-3)發(fā)揮作用繼而導致細胞周期阻滯及細胞衰亡［29-30］。p53抑癌基因參與凋亡程序中幾乎所有主要步驟，是細胞凋亡與腫瘤發(fā)生的關鍵調控因子。MDM2(Murine double minute 2)是p53的主要調節(jié)分子，通過直接相互作用抑制p53的功能。Dai等采用免疫共沉淀法考察了p53與MDM2相互作用，結果表明與p53結合的MDM2表達量隨著harmine濃度的增加而大幅降低，內源性p53表達量則被提高，表明harmine對內源性p53與MDM2相互作用的抑制能力呈劑量依賴性。在穩(wěn)定性實驗中，harmine顯示出能夠保護p53不被蛋白合成抑制劑放線菌酮 (CHX)降解，提升p53穩(wěn)定性的作用［8］。同時，在B16F-10細胞中harmine還顯示出抑制p53及其靶基因mRNA表達的效果［15］。

2.2.4 NF-κB信號通路 NF-κB信號轉導通路通常被認為是細胞存活的因素，參與死亡受體途徑并能激活 bcl-2、bcl-xL等抗凋亡基因。NF-κB蛋白家族包括一系列轉錄因子，這些轉錄因因子在炎癥反應、細胞增殖和抗凋亡的信號轉導方面起決定性的作用［31-32］。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA實驗)測定B16F-10細胞中NF-κB的亞單位p65、p50和c-Rel的表達，研究發(fā)現(xiàn)harmine對細胞內p65、p50和c-Rel的表達均表現(xiàn)出一定程度地抑制作用。這種對NF-κB激活抑制的作用可能由harmine對一系列促炎癥細胞因子 (TNF-α、IL-1β、IL-6和GM-CSF)的抑制而引起的［15］。

2.2.5 PARP酶 聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶 (Poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一種DNA修復酶。是定位在細胞核內，與應激條件下DNA修復密切相關的一種酶。在體內是caspase-3的主要剪切對象。RARP剪切被認為是細胞凋亡的一個重要指標，也通常被認為是caspase-3激活的指標［33］。張曉凱等發(fā)現(xiàn) harmine作用 AsPC-1細胞，顯示PARP蛋白表達減少并被切割［22］。Dai等的研究顯示 HUVECs中PRAP蛋白的表達的減少、Cleaved PRAP表達量的增多也與harmine呈劑量依賴關系［8］。

2.2.6 核酸酶CAD 細胞凋亡通常伴隨著DNA的降解與染色質固縮。除了人們早期研究發(fā)現(xiàn)的可以導致DNA斷裂的DNase I，DNaseII，DNaseγ以及Cyclophilins等因素以外，研究人員又發(fā)現(xiàn)了一種擁有這種活性的分子CAD及其抑制劑 ICAD［34］。CAD(Caspase-activated deoxyribonuclease)是一種能夠降解細胞DNA，并使染色質固縮的一類核酸酶。通常情況下，CAD與ICAD以無活性的方式復合物方式存在，而凋亡細胞中活化的caspase-3可以切割CAD并消除其對CAD的抑制效果［35-36］。劉俊玲等研究發(fā)現(xiàn)，未藥物作用的Jurkat細胞高度表達ICAD，隨著harmine藥物濃度的增加，ICAD的表達量降低，表明harmine能夠通過抑制ICAD，在Jurkat細胞凋亡的信號途徑中發(fā)揮作用［14］。

2.2.7 細胞周期調控蛋白 細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclins-dependent-kinases)和細胞周期蛋白Cyclins參與細胞周期調控。其復雜的活動與細胞周期的各個環(huán)節(jié)的緊密相關［37］。作為p53基因的直接靶點，Cyclin A與CDK2結合后激活CDK2，促進細胞由G2期進入M期，G1期進入S期，進而促進了腫瘤細胞的增殖，加速腫瘤的生長侵潤及轉移。研究表明，細胞外的激酶實驗以及在血管內皮細胞HUVES中，CDK2和Cyclin A均受到harmine抑制作用的影響［8］。同時，harmine對其他周期蛋白如 Cdk1、Cdk5、cyclinB1和CDC2也有類似的抑制效果［38］。

3 結語

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個復雜生理病理現(xiàn)象，隨著對細胞凋亡機制研究的逐步深入，人們越來越意識到細胞凋亡信號轉導對癌癥疾病進程的重要作用。在傳統(tǒng)民間用藥積累的經(jīng)驗基礎上，針對藥用植物中有效單體化合物的研究受到廣泛重視。駱駝蓬提取物harmine，在多種腫瘤細胞中被確證可以通過誘導凋亡在體內外發(fā)揮抗腫瘤活性。而harmine對細胞凋亡信號轉導通路上各步驟的關鍵酶以及重要調控分子的影響，可能是其誘導凋象的分子機制。相信隨著對harmine抗腫瘤作用機制研究的不斷深入，harmine將會成為癌癥化學治療的一種新選擇。

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