紫背金盤中痢止蒿甲素、β-蛻皮激素、8-乙?；淋盏臏y(cè)定

梁曉嵐，易剛強(qiáng)，何桂霞，干 麗，李嘉瀅，李云耀

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙 410208)

紫背金盤為唇形科筋骨草屬植物紫背金盤Ajuga nipponensis Makino的全草，又名散瘀草、散血丹，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，具有清熱解毒、涼血散瘀、抗炎消腫止痛之功效。民間常用紫背金盤及其同屬植物治療肺熱咳嗽、咽喉腫痛、癰腫瘡癤及各種炎癥［1-2］?，F(xiàn)代藥理作用研究發(fā)現(xiàn)紫背金盤還具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抑菌，抗腫瘤，降壓等多種活性［3-9］。其主要化學(xué)成分類型有二萜類、環(huán)烯醚萜類、甾體酮類［10-11］，紫背金盤中相關(guān)成分的定量測(cè)定方法尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取了痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋?種具有顯著藥理作用的成分進(jìn)行HPLC分析，建立HPLC定量測(cè)定方法，為紫背金盤藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀 (安捷倫化學(xué)工作站)、TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) (島津儀器有限公司)、分析天平 (島津AUW220D，十萬分之一);紫背金盤采集于湖南省寧鄉(xiāng)縣，批號(hào)為20110503、20120507、20130505，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)彭菲教授鑒定為唇形科筋骨草屬植物紫背金盤Ajuga nipponensis Makino的全草，標(biāo)本存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室。藥材常溫下陰干后粉碎，過20目篩，得細(xì)粉，備用。痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋諏?duì)照品由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室從紫背金盤全草中分離純化所得，經(jīng)HPLC測(cè)定純度大于99%。乙腈為色譜純 (Sigma公司)，水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 SinoChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為25℃，體積流量0.8 mL/min。痢止蒿甲素檢測(cè)波長(zhǎng)為228 nm，流動(dòng)相為乙腈-水 (70∶30);β-蛻皮激素檢測(cè)波長(zhǎng)為243 nm，流動(dòng)相為乙腈-水 (18∶82);8-乙?；淋諜z測(cè)波長(zhǎng)為212 nm，流動(dòng)相為乙腈-水(13∶87)。痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋諏?duì)照品在各自色譜條件下分別在19.791、21.762、16.591 min處出峰，樣品中相關(guān)檢測(cè)對(duì)象的色譜峰保留時(shí)間均與對(duì)照品保留時(shí)間一致，且與其他峰分離度好，結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 痢止蒿甲素對(duì)照品 (A)和供試品 (B)HPLC色譜圖Fig.1 Chromatograms of reference substance of ajuforrestin A(A)and sample(B)

圖2 β-蛻皮激素對(duì)照品 (A)和供試品 (B)HPLC色譜圖Fig.2 Chromatograms of reference substance of ecdysterone(A)and sample(B)

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取痢止蒿甲素3.0 mg、β-蛻皮激素 5.0 mg和 8-乙?；淋?0.0 mg，分別置于25 mL、25 mL、50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即配得0.12 mg/mL的痢止蒿甲素標(biāo)準(zhǔn)液、0.2 mg/mL的β-蛻皮激素標(biāo)準(zhǔn)液和0.2 mg/mL的8-乙酰基哈帕苷標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)樣前分別過0.45 μm微孔濾膜即可。

圖3 8-乙酰基哈帕苷對(duì)照品 (A)和供試品 (B)HPLC色譜圖Fig.3 Chromatograms of reference substance of 8-o-acetylharpagide(A)and sample(B)

2.3 供試品溶液制備 取紫背金盤藥材粉末3份，每份約取5.0 g，精密稱定，分別置于500 mL圓底燒瓶中，加入50倍量95%的乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，回收溶劑至干得3份醇提浸膏。取適量甲醇將3份浸膏溶解并分別定容至25 mL、25 mL、100 mL，分別作為痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷的樣品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL的痢止蒿甲素、0.2 mg/mL的β-蛻皮激素和0.2 mg/mL的8-乙酰基哈帕苷對(duì)照品2、6、10、14、18、20 μL，按 “2.1”項(xiàng)下的色譜條件分別測(cè)定，以色譜峰面積值 (Y)對(duì)進(jìn)樣量 (X，μg)進(jìn)行線性回歸，得痢止蒿甲素回歸方程為Y=4619.8X+127.43(r=0.9984);β-蛻皮激素回歸方程為Y=2046.7X+13.219(r=0.9962);8-乙酰基哈帕苷回歸方程為Y=246.01X+32.18(r=0.9986)。結(jié)果表明，痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷分別在0.24 ～2.40 μg，0.40 ～4.00 μg，0.40 ～ 4.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，分別測(cè)定其色譜峰面積。痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋辗迕娣e的RSD分別為0.31%、0.54%和0.82%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液在0、6、12、18、24 h分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定各成分峰面積。結(jié)果6次進(jìn)樣痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋辗迕娣e的RSD分別為0.41%、0.60%和0.84%，結(jié)果表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批紫背金盤藥材粉末 (批號(hào)20130505)6份，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，平行制備痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋盏臉悠啡芤焊?6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣20 μL，測(cè)定各成分峰面積的RSD依次為0.42%，0.64%，0.75%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含有量的同一批紫背金盤藥材粉末 (批號(hào)20130505)9份，每份約1.0 g，分別加入一定量的對(duì)照品溶液，各平行3份，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定各成分峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 樣品測(cè)定 取3批紫背金盤藥材樣品，按“2.3”項(xiàng)下樣品溶液的配制方法，分別配制痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋盏臉悠啡芤?，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定各成分峰面積并計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 紫背金盤中痢止蒿甲素、β-蛻皮激素、8-乙?；淋盏牧?(n=3)Tab.2 Content determination of ajuforrestin A，ecdysterone and 8-O-acetylharpagide in Ajuga nipponensis Makino(n=3)

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的確定 通過用紫外檢測(cè)器對(duì)痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙酰基哈帕苷的對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，分別在228 nm、243 nm和212 nm處有最大吸收，3個(gè)成分沒有共同的較大的吸收波長(zhǎng)，故選取228 nm作為痢止蒿甲素的檢測(cè)波長(zhǎng)，243 nm作為 β-蛻皮激素的檢測(cè)波長(zhǎng)，212 nm作為8-乙?；淋盏臋z測(cè)波長(zhǎng)。同時(shí)檢測(cè)3個(gè)成分的方法有待于進(jìn)一步探索。

3.2 紫背金盤質(zhì)量控制探討 選取痢止蒿甲素、β-蛻皮激素和8-乙?；淋?種具有顯著藥理活性的化學(xué)成分，采用高效液相色譜法測(cè)定其在紫背金盤藥材中的含有量，方法專屬性較強(qiáng)、重復(fù)性好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示痢止蒿甲素和β-蛻皮激素在藥材中的量相對(duì)較低，而8-乙酰基哈帕苷的量較高，達(dá)到了0.28%，可考慮將此成分作為紫背金盤藥材鑒定及質(zhì)量控制的重要指標(biāo)成分。

［1］吳其浚.植物名實(shí)圖考［M］.上海:商務(wù)印書館，1957:393-394，445.

［2］蔡光先.湖南藥物志:第7冊(cè)［M］.長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2004:614.

［3］易剛強(qiáng)，李云耀，李曉龍，等.紫背金盤水提物和醇提物解熱作用的研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(11):26-27.

［4］易剛強(qiáng)，陳曉陽(yáng)，李云耀，等.紫背金盤提取物抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(5):1157-1158.

［5］易剛強(qiáng)，李云耀，李曉龍，等.紫背金盤水提物和醇提物抑菌作用的研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，31(3):31-32.

［6］謝浙裕，秦明珠，房玉玲.8-乙酰基哈帕苷的藥理作用［J］.國(guó)外醫(yī)藥植物藥分冊(cè)，2005，20(2):56-58.

［7］Takasaki M，Tokuda H，Nishino H，et al.Cancer chemopreventive agents(Antitumor-promoters)from Ajuga decumbens［J］.J Nat Prod，1999，62(7):972-975.

［8］孟 歌，張可杰，張明智.夏枯草的化學(xué)成分和抗癌活性研究［J］.西北藥學(xué)雜志，2007，22(4):211-213.

［9］王實(shí)強(qiáng)，許 敏.筋骨草總二萜的降壓實(shí)驗(yàn)研究［J］.湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，1996，2(3):28-29.

［10］中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所昆蟲激素組.紫背金盤中植物蛻皮激素的分離和鑒定［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，1981，39(5):466-469.

［11］李衛(wèi)文，吳文玲，劉守金，等.筋骨草屬植物的化學(xué)成分［J］.安徽醫(yī)藥，2009，13(3):329-336.