龜鹿二仙膠對鉛鼠海馬CA1區(qū)長時程增強損傷的修復作用

吳傳云，阮迪云，董昌武，吳云龍，周雪梅，王建青

(1.安徽中醫(yī)藥大學中醫(yī)臨床學院，安徽 合肥 230038;2.中國科技大學生命科學院，安徽 合肥 230027)

WHO Prues博士的調(diào)查表明，全球有近半數(shù)5歲以下兒童的血鉛水平超過10 μg/dL，其形勢在發(fā)展中國家尤為嚴峻［1］。鉛中毒在我國的流行率高達30% ～50%，而且有顯著的地域差異［2-3］。

產(chǎn)前和早期鉛暴露影響新生兒的體重身高及胎兒的生長發(fā)育［4-5］。鉛改變了多巴胺能、膽堿能和谷氨酸能的神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及其信號轉(zhuǎn)導［6］，只要血鉛水平達到10 μg/dL，就可能會導致腎小管損傷、神經(jīng)生理和認知缺陷、聽覺系統(tǒng)和兒童生長發(fā)育障礙［7-8］。但更多的研究證明，即使兒童血鉛水平低于10 μg/dL，也會有認知、視覺、運動及聽覺系統(tǒng)的功能減退［9-10］。兒童的血鉛水平與智商(IQ)顯著相關(guān)，血鉛水平每上升30～40 μg/dL，IQ值就會降低4～6分，并伴有認知功能和心理行為的改變。發(fā)育早期嚴重鉛中毒會引起腦功能的不可逆損傷。

本研究通過具有滋陰填精、益氣壯陽作用的龜鹿二仙膠對出生后鉛暴露大鼠血鉛、海馬鉛、CA1區(qū)突觸可塑性的影響，探討龜鹿二仙膠修復鉛致學習記憶功能損傷的機制，為兒童鉛中毒的中醫(yī)藥防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗所用SD大鼠由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號:scxk(皖)2011-002，盡所有的努力，減少所用動物的數(shù)量及其痛苦。嚴格控制環(huán)境溫度 (24±1)℃及相對濕度 (50±10)%，保持通風，并維持每天都有12∶12的白晝黑夜節(jié)律。

本實驗采用本實驗室以前用過的鉛暴露模型［11］，分娩當天將仔鼠隨機分為4個實驗組:(1)正常組;(2)正常+龜鹿二仙膠組;(3)鉛組;(4)鉛+龜鹿二仙膠組。鉛組、鉛+龜鹿二仙膠組母鼠在哺乳期間，仔鼠從第21天斷奶到第60天，一直飲用含有0.2%(1090 mg/kg)的醋酸鉛的飲用水，而其它對照組大鼠一直飲用去離子水。出生后第60天，測定血鉛水平，判斷鉛中毒程度。用中藥 (龜鹿二仙膠，1.17 g/kg)給正常+龜鹿二仙膠組及鉛+龜鹿二仙膠組的仔鼠灌胃2周，同時給正常組的仔鼠以0.9%生理鹽水灌胃。隨后進行電生理記錄實驗。實驗確保每組動物雌雄數(shù)目相同。

1.2 血液和海馬鉛水平測定 電生理實驗結(jié)束后心臟取血2 mL，所有的樣品均保留一式兩份。采用石墨爐原子吸收光譜法測血鉛。在整個測定過程中一直要嚴格控制外源性鉛污染。按步驟嚴格進行鉛標準品、質(zhì)控及樣品吸光度值測定，最后根據(jù)標準曲線推算出血鉛水平?？焖賱?nèi)嶒灤笫蟮暮ｑR立即冷藏，以備測海馬鉛水平用。采用液態(tài)等離子質(zhì)譜儀 (VG Elemental，UK)分析硝解后的海馬樣本，測定鉛水平。

樣品處理過程:在洗凈并蒸干的玻璃小燒杯中稱量樣品，加入2 mL的MOS級濃HNO3，低溫加蓋加熱樣品溶液至近干，補加HNO31 mL及5滴MOS級濃HClO4，繼續(xù)加蓋加熱至燒杯內(nèi)白煙冒盡，期間不斷搖晃燒杯，使燒杯內(nèi)溶液分布均勻，以免局部過度受熱結(jié)碳，冷卻，加上述HNO34滴及少量水，充分振蕩搖勻，定容為 5.00 mL，待測。

1.3 海馬CA1區(qū)長時程增強 (LTP)的在位電生理記錄 海馬場電位記錄按文獻報道的方法進行［12-14］。采用腹腔注射1.8 g/kg 10%烏拉坦麻醉大鼠，在實驗需要時可補充至外科水平。將其頭部固定在立體定位儀 (江灣1型)上，暴露頭骨。監(jiān)測直腸溫度，用自動加熱墊維持在 (37±0.5)℃。用雙極鎢絲電極作刺激電極，定位于CA1區(qū)海馬薛氏側(cè)枝/聯(lián)合纖維(前囟后4.2 mm，中縫右旁3.8 mm，深度約2.8 mm)，記錄電極定位于海馬CA1區(qū)的近端樹突層 (前囟后3.4 mm，中縫右旁2.5 mm，深度約2.0 mm)。該套管包括兩個相互隔離的鎢絲電極 (特氟龍酯覆蓋厚度為230 μm)和一個引導管 (尺寸為26號)。兩鎢絲電極黏附在不銹鋼的引導管兩側(cè)，從引導管末端伸出800 μm。將引導管的內(nèi)管 (尺寸為31號)插入到海馬CA1區(qū)記錄位點上方約300 μm處。將內(nèi)管通過聚乙烯管連接微量注射器 (Hamiltonsyringe，10 μL)。來源于CA1區(qū)的電信號被放大1000倍，濾波帶寬為1～3 kHz，在10 kHz數(shù)值化。記LTP時，刺激強度調(diào)整為最大場興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)的40%～50%時的強度。強直刺激前記錄20 min基線 (變化幅度＜10%)。強直刺激的參數(shù)設(shè)定為:主間隔1 s，即每隔1 s給一串刺激，每串包括200 Hz，20個pulse，共給5個串，隔1 min重復6次。在強直刺激后恢復之前的單脈沖刺激并記錄1 h以上。

1.4 試驗藥物 龜鹿二仙膠由澳門同福堂黃家濟志藥行生產(chǎn)，生產(chǎn)批號HKP-05148。所用試劑質(zhì)量均為最高等級，所有溶液均在實驗前臨時配制。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 把以fEPSP的起始斜率作為參數(shù)來衡量實驗反應(yīng)的大小，將20 min的基線反應(yīng)作為平均的基值 (100%)，高頻刺激后60 min的fEPSP幅度疊加的平均值除以高頻刺激前基線反應(yīng)的平均基值的結(jié)果是LTP的幅度。實驗所取得的電生理數(shù)據(jù)均用 Igor 4.0(Wave Metrics，OR，USA)分析獲得，然后用Origin 8.0(OriginLab，MA，USA)進行統(tǒng)計處理。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用均數(shù) (Mean)±平均標準誤差 (Standaxd Error Mean，SEM)表示，統(tǒng)計結(jié)果用One-way ANOVA分析，Bonferroni test矯正，以P＜0.05為有顯著性差異。

2 實驗結(jié)果

2.1 龜鹿二仙膠不能降低染鉛大鼠的血鉛水平實驗各組大鼠全血血鉛水平測定結(jié)果見表1。可以看出，染鉛組大鼠血鉛水平比正常對照組明顯升高，有顯著性差異 (P＜0.01);而同期龜鹿二仙膠治療組血鉛水平比染鉛組沒有明顯降低，表明龜鹿二仙膠沒有降血鉛作用。提示龜鹿二仙膠對于鉛中毒的修復作用可能不是通過降血鉛來完成的。

表1 龜鹿二仙膠對鉛鼠血鉛水平的影響Tab.1 Effects of Guilu Erxian Gel on blood lead level in lead-exposed rats

2.2 龜鹿二仙膠部分降低染鉛大鼠的海馬鉛水平 實驗各組海馬鉛水平詳細列在表2中，染鉛組的海馬鉛水平明顯高于正常對照組 (P＜0.01)，表明本實驗鉛暴露模型的成功，用龜鹿二仙膠治療2周后海馬鉛水平與鉛組有顯著差異 (P＜0.01)，但仍高于正常組 (P＜0.01)。這些檢測結(jié)果表明，慢性鉛暴露增加了大鼠海馬鉛水平，而龜鹿二仙膠的干預可以部分減少由此引起的海馬鉛水平的上升。

表2 龜鹿二仙膠對鉛鼠海馬鉛水平的影響Tab.2 Effects of Guilu Erxian Gel on hippocampal lead level in lead-exposed rats

2.3 龜鹿二仙膠對染鉛大鼠海馬CA1區(qū)LTP損傷有部分修復作用 圖1顯示的是龜鹿二仙膠對正常組、鉛組、正常+龜鹿二仙膠組、鉛+龜鹿二仙膠組大鼠LTP的誘導和維持的影響。正常組(195.8%±10.8%，n=8)與正常+龜鹿二仙膠組 (199.7%±14.3%，n=8)LTP幅度無顯著差異 (P＞0.05)。提示龜鹿二仙膠對正常對照組海馬CA1區(qū)LTP的幅度沒有影響。實驗發(fā)現(xiàn)鉛組大鼠LTP的幅度顯著下降到 (145.7% ±11.7%，n=7)(P＜0.01)，雖然鉛鼠經(jīng)過龜鹿二仙膠治療后的LTP幅度 (175.6%±10.8%，n=7)明顯高于鉛組 (P＜0.05)，但仍低于正常組的LTP幅度(P＜0.05)。這些結(jié)果表明，在大鼠發(fā)育期鉛暴露時，龜鹿二仙膠能夠在一定程度上保護但不能完全逆轉(zhuǎn)鉛誘導的海馬CA1區(qū)LTP的損傷，龜鹿二仙膠部分修復了慢性鉛暴露組LTP幅度的損傷。

圖1 龜鹿二仙膠對鉛鼠海馬CA1區(qū)LTP損傷的影響Fig.1 Effects of Guilu Erxian Gel on lead-induced LTP impairment in the CA1area

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)是鉛中毒的主要攻擊目標。科學家們推測，正是由于胎兒大腦的血腦屏障未發(fā)育完全并且缺乏能結(jié)合鉛的某些保護性組織蛋白，才使得它特別易于受到鉛毒性的影響［15］。本研究旨在驗證鉛中毒導致的智力損傷可以用龜鹿二仙膠加以預防這一假設(shè)。本實驗結(jié)果也證明了龜鹿二仙膠對鉛暴露組大鼠海馬SC-CA通路LTP損傷有一定的修復作用。

中醫(yī)認為鉛味甘，性寒，有小毒。鉛性寒，為陰邪，易傷陽氣，導致脾腎陽虛證，終則陰陽兩虛。未成年人鉛中毒當屬腎精不足證，多因先天稟賦不足 (由母體染毒)，或后天失養(yǎng) (后天染毒)，小兒腎精不充，不能主骨生髓充腦，不能化生氣血，生長肌肉，則發(fā)育遲緩，身材矮小，囟門遲閉，智力低下，骨骼萎軟，動作緩慢，腰酸，健忘。本研究以此為理論依據(jù)，治療時選擇具有滋陰填精益氣壯陽作用的龜鹿二仙膠。方劑由鹿角、龜甲、枸杞子、人參組成，龜鹿皆靈而有壽，可補腎、補血、補精、補氣，再加上人參、枸杞，益氣生精，諸藥相配，能補陰益陽，延年益壽，生精補腎。

海馬是鉛的最重要的靶組織，也是學習記憶所必需的腦結(jié)構(gòu)。迄今為止，公認的學習記憶的基礎(chǔ)是突觸可塑性，長時程增強 (LTP)是最經(jīng)典的突觸可塑性的細胞模型［16］。海馬牽涉到外顯記憶，并在記憶的編碼和形成中起關(guān)鍵作用［17］。海馬包括三個分區(qū):CA1區(qū)，CA3區(qū)和 DG區(qū)，確切的說，CA1區(qū)是海馬空間記憶的重要區(qū)域，學習記憶以突觸可塑性的形式在這里在編碼，鞏固和儲存［18-19］。突觸可塑性依賴于不同突觸前、后神經(jīng)元機制及其周圍的膠質(zhì)細胞，記憶的產(chǎn)生涉及突觸可塑性的持續(xù)性變化，突觸前后的許多成分參與了LTP的產(chǎn)生。許多研究表明鉛損傷了發(fā)育期大鼠海馬的CA1區(qū)和齒狀回的LTP的誘導，幅度和維持時間［20-22］。在本實驗中也取得了類似的結(jié)果，鉛組大鼠LTP的幅度明顯下降。

龜鹿二膠中含有豐富的微量元素鋅，有研究表明，補鋅可拮抗慢性鉛暴露導致的血及海馬中鉛含量的升高，增加海馬中BDNF mRNA的表達，并可減輕鉛對小鼠學習記憶的損傷［23-24］。本研究中，發(fā)育期鉛暴露組與正常對照組相比，血鉛水平顯著增加。這些血鉛水平類似于本課題組以前的實驗結(jié)果［22］。同時也發(fā)現(xiàn)龜鹿二仙膠可以部分降低海馬鉛水平，雖然沒能降低血鉛水平，但這可能和鉛的代謝特點有關(guān)。本實驗結(jié)果還證實了龜鹿二仙膠可以部分修復鉛導致的LTP的幅度降低，提示龜鹿二仙膠可能對慢性鉛暴露引起的智力損傷有正面影響。以上實驗證明，龜鹿二仙膠能保護發(fā)育期大鼠的突觸可塑性免受出生后鉛暴露引起的損傷。關(guān)于龜鹿二仙膠對鉛致智力損傷的修復機理還需要進一步進行更深層次的研究。龜鹿二仙膠與不同程度鉛中毒及不同發(fā)育期的鉛中毒之間的關(guān)系還需要進一步的實驗加以論證。

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