響應(yīng)面分析法優(yōu)化慢性濕疹搽劑提取工藝

易東陽(yáng)，李勇華

(重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 404120)

慢性濕疹搽劑由苦參、紅活麻、蜂房、枯礬、生地、赤芍、牡丹皮、白鮮皮、蒺藜、蛇床子等10味中藥組成，具有養(yǎng)血涼血、滋陰潤(rùn)燥、祛風(fēng)止癢之效，主治血虛風(fēng)燥型慢性濕疹。該制劑在重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院臨床使用已有10余年，療效明顯，且無明顯不良反應(yīng)。傳統(tǒng)一直依據(jù)經(jīng)驗(yàn)對(duì)處方中的苦參、紅活麻、生地、赤芍、牡丹皮、白鮮皮等藥材進(jìn)行煎煮提取，為對(duì)提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法［1-7］，對(duì)慢性濕疹搽劑提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括Alltech Model 428 HPLC Pump，Alltech UVIS 201型紫外檢測(cè)器，HT-230A型柱恒溫箱，Chromatography Data System色譜工作站 (美國(guó)奧泰公司)，色譜柱 Penomenex C18柱 (250 mm ×4.8 mm，5 μm)。AUW-120D型電子天平，(日本島津制作所株式會(huì)社)。

苦參 (Sophorae Flavescentis Radix)、蜂房 (Vespae Nidus)、枯礬 (Alumen)、生地 (Rehmanniae Radix)、赤芍(Paeoniae Radix Rubra)、牡丹皮 (Moutan Cortex)、白鮮皮(Dictamni Cortex)、蒺藜 (Fructus Tribuli)、蛇床子 (Cnidhi Fructus)等藥材均購(gòu)自重慶市萬州區(qū)國(guó)藥集團(tuán)，由重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校胡玉彬副教授鑒定，藥材質(zhì)量符合《中國(guó)藥典》2010年版規(guī)定;紅活麻購(gòu)自重慶市儲(chǔ)奇門藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校胡玉彬副教授鑒定為蕁麻科艾麻屬植物珠芽艾麻L(zhǎng)aportea bulbifera(Sieb.et Zucc.)Wedd.的干燥根;苦參堿對(duì)照品 (批號(hào)110805-200508，中國(guó)食品藥品檢定研究院);試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

測(cè)定不同提取方法所得樣品溶液的固體得率和苦參堿的量，分別乘以一定權(quán)重系數(shù)，采用綜合評(píng)分作為提取工藝的考察指標(biāo)。

2.1 苦參堿的測(cè)定［8-12］

2.1.1 色譜條件 以氨基鍵合硅膠為填充劑;以0.0085 mol/L的醋酸銨甲醇溶液 (V甲醇∶V水=9∶1)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。

2.1.2 溶液的制備

2.1.2.1 樣品提取溶液的制備 按處方比例以一劑的處方量稱取各藥材，按一定的加水量、提取次數(shù)、每次提取時(shí)間進(jìn)行提取、過濾，濾液濃縮至60 mL。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 精密量取上述樣品溶液10 mL，加水10 mL，用濃氨試液調(diào)節(jié)至pH9～10，置分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，每次20 mL，合并三氯甲烷萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL溶解，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，加在中性氧化鋁柱 (100～200目，5 g，內(nèi)徑1 cm)上，依次以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (7∶3)混合溶液各20 mL洗脫，合并收集洗脫液，回收溶劑至干，殘?jiān)訜o水乙醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 取苦參堿對(duì)照品適量，精密稱定，加乙腈-無水乙醇 (80∶20)混合溶液分別制成每1 mL含苦參堿50 μg的溶液，即得。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取苦參堿對(duì)照品7.92 mg，置25 mL量瓶中，加乙腈-無水乙醇 (80∶20)混合溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液貯備液 (316.8 μg/mL);精密量取對(duì)照品溶液貯備液適量，分別加乙腈-無水乙醇 (80∶20)混合溶液稀釋制成每1 mL中含苦參堿為23.76、47.52、95.04、190.08、380.16 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下，分別測(cè)定不同質(zhì)量濃度的苦參堿對(duì)照品溶液，以峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=20817C+27115(r=0.9999)，苦參堿溶液在23.76～380.16 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其峰面積與測(cè)定質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取苦參堿對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并記錄其峰面積，計(jì)算RSD為0.33%，表明精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，測(cè)定并記錄其峰面積，計(jì)算RSD為0.19%，說明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)提取液，照“2.1.2”項(xiàng)供試品溶液的制備項(xiàng)下平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄其峰面積，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的RSD為0.46%，表明重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知苦參堿含有量的樣品6份，加入相應(yīng)對(duì)照品溶液適量，制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄其峰面積，結(jié)果苦參堿平均回收率102.2%，RSD為1.96%。說明該方法可行。

2.1.8 苦參堿的測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定，計(jì)算，即得。

2.2 提取液固體得率的測(cè)定 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下樣品提取溶液20 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒定質(zhì)量，計(jì)算，即得。

2.3 考察指標(biāo)的確定［13-16］將苦參堿的質(zhì)量濃度 (Y1:mg/mL)與固體得率 (Y2:g/mL)分別以不同權(quán)重進(jìn)行處理，按公式Y(jié)=0.7 Y1+0.3Y2計(jì)算，得綜合評(píng)分作為考察指標(biāo)。

2.4 單因素考察

2.4.1 提取時(shí)間對(duì)考察指標(biāo)的影響 按處方比例稱取藥材，分別選定提取時(shí)間為30、60、90、120、180 min，設(shè)定加水量為藥材質(zhì)量的8倍，提取次數(shù)為2次，提取樣品(每組3份)，按供試品溶液的制備方法，制備1～5組供試品溶液，計(jì)算固體得率，按苦參堿的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，考察不同提取時(shí)間對(duì)固體得率和苦參堿量的影響，按“2.3”項(xiàng)下計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果分別為0.112、0.165、0.173、0.181、0.180，提取時(shí)間為120 min時(shí)，固體得率與苦參堿的綜合得分最高，180 min之后隨著時(shí)間的加長(zhǎng)反而有點(diǎn)下降，可能與煎煮時(shí)間過長(zhǎng)有一定影響。

2.4.2 加水量對(duì)考察指標(biāo)的影響 按處方比例稱取藥材，分別選定加水量為藥材量的5、8、10、15、20倍，設(shè)定提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)為2次，提取樣品 (每組3份)，按供試品溶液的制備方法，制備1～5組供試品溶液，計(jì)算固體得率，按“2.3”項(xiàng)下計(jì)算綜合評(píng)分，按苦參堿的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，考察不同加水量對(duì)固體得率和苦參堿量的影響，按“2.3”項(xiàng)下計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果分別為0.136、0.166、0.179、0.181、0.182。當(dāng)加水量為藥材量的20倍，固體得率與苦參堿的綜合得分最高，但藥材加水量達(dá)到藥材量的10倍以后，繼續(xù)加大加水量對(duì)固體得率與苦參堿的綜合得分無顯著影響。

2.4.3 煎煮次數(shù)對(duì)考察指標(biāo)的影響 按處方比例稱取藥材，分別選定煎煮次數(shù)為1、2、3、4、5次，設(shè)定加水量為藥材質(zhì)量的8倍，提取時(shí)間60 min，提取樣品 (每組3份)，按供試品溶液的制備方法，制備1～5組供試品溶液，計(jì)算固體得率，按苦參堿的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，考察不同煎煮次數(shù)對(duì)固體得率和苦參堿量的影響，按“2.3”項(xiàng)下計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果分別為0.09、0.164、0.186、0.189、0.191。當(dāng)煎煮次數(shù)為5次時(shí)，固體得率與苦參堿的綜合得分最高，但當(dāng)煎煮次數(shù)達(dá)到3次以上后，繼續(xù)增加煎煮次數(shù)對(duì)固體得率與苦參堿的綜合得分無顯著影響。

2.5 慢性濕疹搽劑提取工藝條件的優(yōu)化

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果 在單因素考察的基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面的因素和水平，因素水平見表1。根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理確定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果，見表2。

2.5.2 模型擬合及預(yù)測(cè) 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案制備出15組供試品 (每組2份)，計(jì)算固體得率并按照苦參堿的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，通過計(jì)算得出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2。通過design-expert 7.0軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素編碼值進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程如下:Y=+21.48+1.01X1+1.10X2+2.04 X3+0.35X1X2+0.13 X1X3－0.15X2X3－1.40－3.13－2.20。方差分析結(jié)果見表3。

表1 慢性濕疹搽劑提取工藝響應(yīng)面分析因素水平

表2 慢性濕疹搽劑提取工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

表3 慢性濕疹搽劑提取工藝回歸模型與方差分析

由表3可知，用上述回歸方程描述各因數(shù)與相應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，在置信區(qū)間95%時(shí)，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著 (r=0.9671)，模型的顯著性水平遠(yuǎn)低于0.05，表明模型項(xiàng)是顯著的。方程失擬項(xiàng)較小，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合良好，實(shí)驗(yàn)誤差小。因此，可以用該方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。方程各自變量X方差分析表明，方程一次項(xiàng)對(duì)提取響應(yīng)值具有顯著性影響，影響的大小順序依次為提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水倍數(shù)，其中提取次數(shù)對(duì)提取響應(yīng)值影響最為顯著。方程二次項(xiàng)對(duì)提取響應(yīng)值具有顯著性影響，但交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3對(duì)提取響應(yīng)值無顯著性影響，因此各因素與響應(yīng)值之間不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.5.3 等高線圖和響應(yīng)面圖分析 根據(jù)回歸分析結(jié)果，用design-expert 7.0軟件作出響應(yīng)曲面圖和等高線圖，見圖1～3。各圖表示X1、X2、X3中任意一個(gè)變量在取值范圍內(nèi)，其余2個(gè)變量對(duì)提取響應(yīng)值的影響。

圖1 加水量和提取時(shí)間對(duì)綜合評(píng)分的影響

圖2 加水量和提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響

圖3 提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)綜合評(píng)分的影響

根據(jù)以上響應(yīng)面圖，可以判斷該實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)只有一個(gè)穩(wěn)定點(diǎn)，且為極大值，同時(shí)表明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合理。因此，用design-expert 7.0軟件，由RSM預(yù)測(cè)得出慢性濕疹搽劑的最佳提取工藝條件為:加水倍數(shù)12.03，提取時(shí)間131.23 min，提取次數(shù)3.47，結(jié)合單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)實(shí)際的操作性，確定其最佳提取工藝為加水倍數(shù)12倍，提取時(shí)間130min，提取次數(shù)3次。理論上慢性濕疹搽劑提取響應(yīng)值最高為0.2226。

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 分別按優(yōu)化的提取工藝提取3批樣品，測(cè)定固體得率和苦參堿量，計(jì)算綜合評(píng)分，慢性濕疹搽劑提取響應(yīng)值為0.2212(RSD=0.42%)，與理論預(yù)測(cè)值相差不大，且高于表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的最高值，說明所建模型正確，且建立的工藝穩(wěn)定、提取率高、重現(xiàn)性好。

3 討論

本研究采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)來進(jìn)行試驗(yàn)，從而避免了均勻設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)不能預(yù)測(cè)出該因素在一個(gè)區(qū)間范圍內(nèi)連續(xù)取值的最佳值的缺陷，且較好地保證了試驗(yàn)精度 (可以分析各因素之間的相互作用)，預(yù)測(cè)性良好。根據(jù)方差分析結(jié)果可見，影響提取效果的大小順序依次為提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水倍數(shù)，其中提取次數(shù)對(duì)提取響應(yīng)值影響最為顯著。這可能與權(quán)重計(jì)算中苦參堿量所占比例較高有關(guān)，因濃度差對(duì)有效成分的溶出影響較大。

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