川貝母藥材生物堿成分HPLC-ELSD特征圖譜的研究

雷艷輝，李會軍，李 萍

(中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇南京 210009)

川貝母基原復(fù)雜，《中國藥典》2010年版規(guī)定了百合科貝母屬6種基原植物，即川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫貝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母 F.przewalskii Maxim.、梭砂貝母F.delavayi Franch、太白貝母F.taipaiensis P.Y.Li或瓦布貝母F.unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var.wabuensis(S.Y.Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu，S.Wang et S.C.Chen［1］。由于這些基原植物分布區(qū)域重疊，種間變異復(fù)雜且外形相似，導(dǎo)致市場上川貝母藥材往往基原混雜。因此，如何準(zhǔn)確鑒別基原對于確保川貝母藥材質(zhì)量具有重要意義。

中藥特征圖譜是指某些藥材、提取物或制劑經(jīng)過適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段對其所含化學(xué)成分進(jìn)行表征，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜或光譜圖。由于色譜分析兼具分離、鑒別以及定量測定的能力，所得到的色譜圖中各色譜峰蘊含有出峰順序、保留時間、峰高、峰面積等信息，因此可以作為綜合的量化色譜鑒別方法。中藥特征圖譜是中藥整體性的化學(xué)表征，與采用單一化學(xué)對照品作對照的鑒別方法相比，具有更好的專屬性［2］，已廣泛應(yīng)用于各種中藥材和成方制劑的質(zhì)量控制［3-10］。在《中國藥典》2010年版中，有7種植物油脂和中藥提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用了特征圖譜鑒別方法。此外，《美國藥典》、《歐洲藥典》、《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》等均收載有植物藥/中藥特征圖譜鑒別方法。

川貝母主含各類甾體生物堿［11］，本實驗采用HPLC-ELSD方法，建立了針對川貝母所含甾體生物堿的特征圖譜，以期對川貝母的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1100 Series高效液相色譜儀 (美國Agilent公司);Alltech2000蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD);Milli-Q純水儀 (美國 Millipore公司);KH-500DB型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);BT25S電子天平 (Sartorius);Heraeus PICO17離心機 (德國 Thermo公司);Oasis MCX 3 cc固相萃取小柱 (美國Waters公司)。

色譜純乙腈 (德國Merck公司)，色譜純甲醇(江蘇漢邦科技有限公司)，其余試劑均為分析純，超純水 (18 MΩ·cm－1)由Milli-Q純水儀制，西貝母堿、貝母辛、貝母素甲和貝母素乙對照品(實驗室自制，HPLC測定純度達(dá)98.5%以上)。

川貝母藥材信息見表1，經(jīng)中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室李萍教授鑒定，憑證標(biāo)本存放于中國藥科大學(xué)生藥學(xué)教研室。

表1 川貝母藥材來源Tab.1 Sources of Fritillariae cirrhosae Bulbus

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Zorbax Extend-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈 (A)-0.1%甲酸 (10 mmol/L甲酸銨，pH=4)(B)，梯度洗脫 (0～15 min，85% ～75%B;15～23 min，75%B;23～35 min，75% ～55%B;35～40 min，55%～0% B);柱溫25℃;體積流量0.8 mL/min;進(jìn)樣體積20 μL;ELSD漂移管溫度108℃;載氣體積流量2.8 L/min。

2.2 混合對照品溶液的制備 取西貝母堿、貝母辛、貝母素甲和貝母素乙對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含西貝母堿0.3 mg、貝母辛0.2 mg、貝母素甲0.3 mg和貝母素乙0.2 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取樣品粉末 (過60目篩)約3 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加5 mL濃氨水密閉浸潤1 h，然后加入60 mL二氯甲烷-甲醇 (4∶1)混合溶劑超聲處理1 h，濾過，濾渣用20 mL混合溶劑洗滌，合并濾液與洗液，蒸干，殘渣用0.1 mol/L鹽酸溶解，準(zhǔn)備進(jìn)行混合型陽離子交換 (MCX)固相萃取。先以3 mL甲醇活化，而后加3 mL水平衡MCX小柱;將0.1 mol/L HCl溶液溶解的樣品轉(zhuǎn)移至已活化的MCX小柱內(nèi);用3 mL 0.1 mol/L HCl及3 mL甲醇依次洗滌小柱除雜;用2 mL 10% 二乙胺甲醇溶液洗脫樣品，洗脫液經(jīng)氮氣吹干后以1 mL甲醇渦旋復(fù)溶，離心取上清液即得。

2.4 方法學(xué)考察 以太白貝母 (TB-1)為實驗材料進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以貝母辛為參照峰，計算特征峰的相對保留時間。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD值均小于0.4%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品 (TB-1)，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，以貝母辛為參照峰，計算特征峰的相對保留時間。結(jié)果各特征峰的相對保留時間的RSD值均小于0.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 耐用性考察

2.4.3.1 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測定，記錄色譜圖，以貝母辛為參照峰，計算特征峰的相對保留時間。結(jié)果各特征峰相對保留時間的RSD值均小于0.5%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3.2 不同體積流量的考察 考察了不同體積流量 (0.8 mL/min、1 mL/min)對相對保留時間的影響。結(jié)果各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于1.9%，表明體積流量對相對保留時間的影響在可接受范圍內(nèi)。

2.4.3.3 不同柱溫的考察 考察了不同柱溫(25℃、30℃、35℃)對相對保留時間的影響。結(jié)果各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于1.0%，表明柱溫對相對保留時間的影響在可接受范圍內(nèi)。

2.4.3.4 不同色譜柱的考察 考察了不同色譜柱Agilent Hypersil BDS-C18(4.0 mm ×250 mm，5 μm)、Kromasil 100-5C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)對相對保留時間的影響。結(jié)果各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于4.5%，表明色譜柱型號對相對保留時間的影響在可接受范圍內(nèi)。

2.4.3.5 不同儀器的考察 考察了不同儀器 (Agilent1100高效液相色譜儀、島津LC-20AB高效液相色譜儀)對相對保留時間的影響。結(jié)果在這兩種不同儀器上，各特征峰分離程度無明顯變化且相對保留時間的RSD值均小于3.0%，表明不同儀器對相對保留時間的影響在可接受范圍內(nèi)。

2.5 川貝母特征圖譜的建立 按“2.1”項下色譜條件對6批太白貝母樣品進(jìn)行檢測，采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”對所得HPLC色譜圖進(jìn)行匹配，時間窗0.50，采用中位數(shù)法生成太白貝母特征圖譜匹配圖，見圖1，其中R為對照特征圖譜。太白貝母特征圖譜中標(biāo)定了8個共有特征峰，其中4、5、6號峰分別是貝母辛、貝母素甲和貝母素乙。以貝母辛為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間 (表2)。

圖1 太白貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.1 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria taipaiensis

表2 太白貝母HPLC特征圖譜共有峰的相對保留時間Tab.2 Relative retention time of common peaks of HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria taipaiensis

采用同樣方法分別生成暗紫貝母、甘肅貝母、瓦布貝母的特征圖譜匹配圖 (圖2～4)。暗紫貝母特征圖譜中標(biāo)定了4個共有特征峰，其中2號峰為貝母辛;甘肅貝母特征圖譜中標(biāo)定了7個共有特征峰，其中4號峰為貝母辛;瓦布貝母特征圖譜中標(biāo)定了8個共有特征峰，其中2、3、4、5號峰分別是西貝母堿、貝母辛、貝母素甲和貝母素乙。限于篇幅，暗紫貝母、甘肅貝母和瓦布貝母特征圖譜共有峰的相對保留時間從略。

7批川貝母和7批梭砂貝母各批次間化學(xué)成分差異較大，無法建立特征圖譜 (其HPLC重疊圖分別見圖5、圖6)。

圖2 暗紫貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.2 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria unibracteata

3 討論

3.1 色譜條件及樣品溶液制備 生物堿類成分在色譜柱上易與反相填料的硅醇基發(fā)生反應(yīng)而拖尾，為了改善樣品的色譜分離行為，參照文獻(xiàn) ［12］的色譜條件，在0.1%甲酸溶液中加入10 mmol/L的甲酸銨，調(diào)pH為4后，發(fā)現(xiàn)生物堿類成分的色譜行為得到明顯改善。

圖3 甘肅貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.3 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria przewalskii

圖4 瓦布貝母HPLC特征圖譜匹配圖Fig.4 HPLC-specific chromatograms of bulbs of Fritillaria wabuensis

圖5 川貝母HPLC重疊圖Fig.5 Overlap of HPLC chromatograms for bulbs of Fritillaria cirrhosa

圖6 梭砂貝母HPLC重疊圖Fig.6 Overlap of HPLC chromatograms for bulbs of Friiillaria delavayi

未經(jīng)前處理的藥材樣品色譜圖較為復(fù)雜，經(jīng)LC-MS鑒定后發(fā)現(xiàn)除了生物堿類成分外，還有一些非生物堿類成分，增加了譜圖的復(fù)雜性。為了富集生物堿類成分，本實驗使用混合型陽離子交換(Mixed-mode cationic-exchange，MCX)固相萃取小柱進(jìn)行樣品前處理。MCX固相萃取柱添加混合型陽離子交換反相吸附劑，具有離子交換色譜和反相色譜的雙重保留模式，對堿性化合物具有高選擇性和高靈敏度，適合用于貝母樣品中生物堿的富集純化。

3.2 特征圖譜的比較 36批川貝母藥材中，太白貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、瓦布貝母各批次藥材化學(xué)組成相對穩(wěn)定，可以建立基于共有峰模式的特征圖譜;而川貝母和梭砂貝母各批次樣品化學(xué)組成差異較大，無法建立特征圖譜。由圖1～4可知，雖然太白貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、瓦布貝母中均含有貝母辛，但整體化學(xué)成分表現(xiàn)出顯著差異，可以通過特征圖譜進(jìn)行鑒別。

［1］國家藥典委員會.中國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:34.

［2］胡漢昆，劉薇芝，劉 萍，等.中藥特征圖譜技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(11):936-938.

［3］顏美秋，陳素紅，呂圭源，等.鐵皮石斛HPLC特征圖譜研究［J］.中國中藥雜志，2013，38(4):516-519.

［4］聶 慧，嚴(yán) 輝，錢大瑋，等.百合藥材UPLC特征圖譜及特征峰 QTOF-MS分析研究［J］.中藥材，2013(7):1087-1092.

［5］姜艷艷，張 樂，劉 娟，等.香櫞、佛手中黃酮類成分含量測定及HPLC特征圖譜研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(20):103-107.

［6］葉家宏，申衛(wèi)紅，黃紅兵，等.青葙子高效液相色譜特征圖譜［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，30(6):897-900.

［7］張永鑫，劉 曉，楊欣文，等.黃連4種飲片特征圖譜研究及生物堿含量測定［J］.藥物分析雜志，2012，32(11):1957-1961.

［8］張子龍，魏 剛，劉東輝，等.大黃及其醇提液HPLC特征圖譜相關(guān)性研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(21):69-73.

［9］孫汝明，李 翔，曹 紅，等.感冒清熱顆粒HPLC特征圖譜研究［J］.藥物分析雜志，2013，33(2):335-339.

［10］羅 曼，周 蘭，申 璀，等.銀翹解毒丸特征圖譜初步研究［J］.中成藥，2012，34(11):2162-2166.

［11］曹新偉，張 萌，李 軍，等.川貝母生物堿類成分的研究［J］.中草藥，2009，40(1):15-17.

［12］Zhou J L，Xin G Z，Shi Z Q，et al.Characterization and identification of steroidal alkaloids in Fritillaria species using liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2010，1217(45):7109-7122.