痰熱清注射液中微量蛋白檢測方法的改進

陳丹丹，張 甦，于 泓，孫 健，胡 青，劉紹勇，季 申*

(1.中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海 200040;2.上海市食品藥品檢驗所，上海 201203;3.上海凱寶藥業(yè)股份有限公司，上海 201401)

中藥注射劑改變了傳統(tǒng)中藥給藥途徑，克服了中藥起效慢的弱點，在臨床中取得了良好的治療效果。但隨著應用范圍的擴大，其引發(fā)的不良反應也備受關注［1-2］。目前相關研究對引發(fā)不良反應的原因尚未有確切結論，從臨床報道的不良反應來看，大多為速發(fā)型過敏反應［3-4］。有研究表明注射劑中存在的高分子活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)在進入人體血液中易形成半抗原，容易引發(fā)過敏反應［5］。為保證注射劑安全性，需要建立準確高效的分析方法對注射劑中微量蛋白進行檢測。

目前中藥注射劑中蛋白的檢測方法主要依據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄IX S有關物質(zhì)檢查法中蛋白質(zhì)的檢查項，該方法執(zhí)行過程中，假陽性、誤檢漏檢等問題突出，無法有效控制注射劑的安全性，急需開發(fā)專屬性強、靈敏度高的替代方法。

痰熱清注射液具有清熱、解毒、化痰的功效，近年來其臨床應用的療效受到廣泛認可［6］，同時也存在不良反應問題［7］。分析其處方包括三味植物藥和兩味動物藥，易產(chǎn)生動物或植物來源蛋白等抗原性雜質(zhì)。而應用現(xiàn)行有關物質(zhì)蛋白質(zhì)檢查時，易產(chǎn)生假陽性情況，存在一定典型性。本研究以痰熱清注射液為模板，對蛋白質(zhì)檢查方法進行了探索，建立了適用性好、通用性強的蛋白檢測方法，可廣泛應用于中藥注射劑的相關檢查。同時對工藝中間體中蛋白進行研究，可以從生產(chǎn)工藝的角度，為研究和解決中藥注射劑的安全性問題提供參考和依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System(美國Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng) (美國 Bio-Rad公司);Mini-PROTEAN TGX Precast Gels(美國Bio-Rad公司);高速冷凍離心機 (德國Hettich 200R);Agilent 1290 Infinity高效液相色譜儀，Agilent 6550 iFunnel Q-TOF質(zhì)譜儀 (美國Agilent公司);HLB固相萃取小柱 (6 mL/200 mg，Waters公司);Sartorius stedim Vivaspin6(超濾濃縮離心管，5000 Da MWCO，德國Sartorius公司);Bio-spin P-6 gel columns(凝膠小柱，又稱凝膠滲透預裝柱，截留 6000 MW limit，美國 Bio-Rad公司)。

1.2 試劑與試藥 通用型蛋白沉淀試劑 ［含沉淀試劑 (一)、沉淀試劑 (二)，上海生工生物工程公司BSP012］;牛血清白蛋白 (BSA)(中國藥品生物制品檢定所，批號140619-200415);SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì) (中國科學院上海生物化學研究所);痰熱清注射液成品 (有效期內(nèi)和過期樣品共計15批)及處方 (黃芩、金銀花、連翹、山羊角、熊膽粉)工藝中間體 (包括制備工藝各關鍵步驟產(chǎn)物)，由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司提供;其余試劑均為色譜純，來自MERCK公司。

2 方法

2.1 樣品選取 實驗研究對象首先選擇痰熱清注射液成品，包括有效期內(nèi)和過期樣品，以全面控制該品種應用安全性，并比較存放時間對于注射劑中蛋白的影響。其次，還針對注射劑各工藝中間體中的蛋白進行研究，以探尋工藝制法對蛋白存在的影響，從而有效指導注射劑生產(chǎn)關鍵步驟，從生產(chǎn)環(huán)節(jié)把控注射劑安全性。增加工藝中間體中蛋白的研究，也可作為方法陽性樣品的補充，以充分驗證方法的可行性。

2.2 樣品前處理方法 目前文獻報道的蛋白前處理方法大致分為沉淀純化和分離純化，基本依據(jù)蛋白的相對分子質(zhì)量大小、電荷差異和疏水性等特性。中藥注射液中蛋白質(zhì)具有微量、未知的特點，且主成分對蛋白分離干擾作用明顯，經(jīng)過綜合分析可行性和前期預實驗基礎上，本實驗主要針對沉淀法、超濾法、凝膠小柱及HLB固相萃取柱進行了研究，均以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)為檢測手段，對不同前處理方法的 效果進行比較，見圖1。

圖1 蛋白前處理技術路線圖Fig.1 Technical routes of protein pre-treatment

2.2.1 沉淀純化法 沉淀純化法是一種廣泛應用于蛋白質(zhì)的富集和提取的方法，其優(yōu)勢在于富集蛋白的同時可有效除去干擾成分，主要包括鹽析與有機溶劑沉淀等方法［8］。常用的有機溶劑包括乙腈和丙酮，在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)由于注射液中所含鹽類成分較多，乙腈加入后出現(xiàn)分層的現(xiàn)象，無法應用。商品化沉淀試劑由蛋白沉淀試劑 (一)、蛋白沉淀試劑 (二)組成，為通用型蛋白沉淀試劑，與有機溶劑沉淀比較，可以實現(xiàn)低濃度蛋白的濃縮和沉淀，去除鹽類等多種雜質(zhì)，適合中藥注射液中微量蛋白的測定，操作簡便。本實驗分別對丙酮試劑沉淀和商品化蛋白沉淀兩種方法進行了考察。

2.2.1.1 丙酮法 取注射液及中間體5 mL，加入5倍體積丙酮 (4℃預先放冷過夜)，混勻，置于－18℃冰箱放置24 h后取出，4℃離心 (7800 r/min)15 min，去除上清液，待沉淀揮干后，加1 mL水使溶解，制得供試品溶液。

2.2.1.2 沉淀試劑法 取注射液及中間體100 μL，加入蛋白沉淀試劑 (一)300 μL，渦旋30 s，4℃放置10 min，再加入蛋白沉淀試劑 (二)300 μL，渦旋30 s，4℃ 放置15 min，于4℃離心 (14000 r/min)15 min，取出后用槍頭盡可能去除上清液，保留沉淀，再加入600 μL乙醚和乙醇混合液(1∶1，V/V)，震蕩后4℃放置10 min，再離心15 min，去除上清液，得蛋白沉淀，最終沉淀物用30 μL水溶解，制得供試品溶液。

2.2.2 分離純化法 分離純化法主要利用分子篩原理和固相萃取兩種手段進行分離提取。根據(jù)分子篩原理的方法包括超濾和透析［9］，由于透析法前處理時間長，收率低，僅選取超濾法作為該手段的典型方法進行研究。對于固相萃取法，由于中藥注射劑中蛋白具有未知的特點，無法使用特異性離子交換柱進行處理，所以重點考察了凝膠小柱及反相固相萃取柱。

2.2.2.1 超濾法 取痰熱清注射液5 mL，置于超濾離心管中 (截流分子量為5000 Da)，離心(12000 r/min)60 min，取上層截留液1 mL，作為供試品溶液。

2.2.2.2 凝膠小柱法 取注射液及中間體100 μL采用bio-rad凝膠小柱對微量蛋白進行富集除雜，操作過程取樣品100 μL上樣，將凝膠小柱在2000 r/min條件下離心4 min，取離心所得溶液作為供試品溶液。

2.2.2.3 HLB柱結合沉淀試劑法 依次用6 mL甲醇、6 mL水活化HLB柱，取注射液5 mL上樣，用10%甲醇3 mL洗脫，收集上樣后流出液及10%甲醇洗脫液混合，取上述混合液100 μL，用蛋白沉淀試劑沉淀，最終沉淀物用30 μL水溶解，作為供試品溶液。

2.3 檢測方法 蛋白檢測采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，取供試品溶液與供試品緩沖液 (3∶1)混合，于100℃水浴加熱5 min，取10 μL上樣。采用4% ～20%梯度膠分離，以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低相對分子質(zhì)量標準蛋白質(zhì)(相對分子質(zhì)量14400～97400 Da)為標準物，針對凝膠電泳的顯色和凝膠濃度進行了相應考察。

2.3.1 顯色方法 目前常用的染色方法為R250考馬斯亮藍染色及銀染法，實驗對兩種顯色方法進行了比較［10］。從檢測靈敏度看，銀染法遠高于考染法，更適合注射劑中微量蛋白的檢測，故采用銀染作為顯色方法。

2.3.2 凝膠濃度考察 研究比較了12%等度膠與4%～20%梯度膠的分離效果，結果標準蛋白質(zhì)中低相對分子質(zhì)量蛋白 (14400Da)在12%等度膠上的條帶接近樣品前沿，容易造成誤判;而4%～20%梯度膠上的斑點分布均勻，樣品前沿不存在干擾，適合該注射劑測定 (見圖2、圖3)。

圖2 12%等度膠電泳圖Fig.2 Electrophoresis of 12%gel

圖3 4%～20%梯度膠電泳圖Fig.3 Electrophoresis of 4%－20%gel

3 結果

3.1 前處理方法比較

3.1.1 沉淀純化法 丙酮沉淀對痰熱清注射液中干擾成分的去除有一定效果，但方法靈敏度低，沉淀時間長，且處理后樣品仍有較多雜質(zhì)，導致電泳銀染背景顏色深，干擾嚴重。

商品化沉淀試劑與丙酮法相比，操作簡便，沉淀時間明顯縮短，同時有效去除雜質(zhì)，靈敏度顯著提高，可用于注射液中間體處理。對痰熱清注射液處理后仍存少量雜質(zhì)干擾，銀染后在凝膠電泳前沿部分容易出現(xiàn)淺黃色背景，對結果判斷造成干擾，見圖4，因此需對該方法進一步優(yōu)化。

圖4 經(jīng)商品化沉淀試劑處理的樣品電泳圖Fig.4 Electrophoresis of sample solutions with preparation by protein precipitation reagent

3.1.2 分離純化法 超濾是蛋白富集的常用方法，實驗嘗試采用超濾法對樣品處理，結果超濾后上層截留液仍較多，且溶液黏度較大，雜質(zhì)去除效果不明顯。凝膠小柱法對注射液中干擾成分的去除有較好的效果，但在加樣試驗過程中發(fā)現(xiàn)，凝膠小柱對微量蛋白有吸附作用，不宜用于注射液中微量蛋白的檢測。

實驗曾嘗試僅采用HLB柱對蛋白富集除雜，但效果欠佳，最終選用HLB柱結合沉淀法，即在商品化沉淀試劑基礎上，結合HLB柱去除部分小分子雜質(zhì)。實驗對加樣溶液中的蛋白洗脫行為進行考察，加樣溶液上樣后，依次采用10%、20%、30%和60%甲醇各3 mL洗脫，收集上樣流出液及各流分洗脫液，經(jīng)SDS-PAGE檢測上樣流出液及10%甲醇洗脫液中可檢測到BSA，其他體積分數(shù)流出液均未檢測到蛋白條帶，見圖5，即10%甲醇溶液可將BSA完全洗脫，因此可收集上樣流出液及10%甲醇洗脫液，實現(xiàn)蛋白純化。該方法可去除注射液中多種雜質(zhì)，有效解決了樣品經(jīng)單一沉淀試劑處理，電泳銀染后背景干擾的問題，達到較好的效果，見圖6。

圖5 痰熱清注射液加樣后HLB柱各洗脫液電泳圖Fig.5 Electrophoresis of eluents of samples solutions with BSA

圖6 HLB固相萃取結合沉淀法的樣品圖Fig.6 Electrophoresis of sample solutions with preparation by HLB and protein precipitation reagent

綜合考慮以上結果，HLB柱結合沉淀法既可實現(xiàn)微量蛋白富集，同時又能有效去除雜質(zhì)，顯著提高電泳檢測時的靈敏度，適合于成分復雜注射液前處理，因此實驗采用該方法對痰熱清注射液進行前處理。對中藥注射液中間體，由于樣品均為單味藥材成分提取物，蛋白含量相對較高且未加入輔料，僅采用商品化沉淀試劑處理后，即可進行電泳銀染顯色。

3.2 方法學考察

3.2.1 檢測限 取痰熱清注射液5 mL，分別精密加入BSA對照品溶液 (101.6 μg/mL)50、100、150、200 μL，后續(xù)操作同 “2.2.2.3”項 HLB柱結合沉淀試劑方法，經(jīng)銀染顯色后觀察條帶，確定該方法檢出限為2.03 μg/mL。

3.2.2 專屬性 取痰熱清注射液5 mL，精密加入BSA 對照品溶液 (101.6 μg/mL)100 μL，后續(xù)操作“2.2.2.3”項HLB柱結合沉淀試劑方法。由于樣品均未檢出蛋白，以加樣樣品作為陽性對照，注射劑作為陰性樣品，照擬定方法操作，結果加樣樣品中有蛋白條帶，樣品中未見蛋白條帶，背景無干擾，說明該方法專屬性較強 (見圖3)。

3.3 痰熱清注射劑檢測結果 按“2.2.2.3”項HLB柱結合沉淀試劑方法，對15批痰熱清注射液進行處理，凝膠電泳檢測銀染顯色后觀察，效期內(nèi)和過期樣品均未檢測到蛋白條帶，結果表明該注射劑中未檢測到蛋白存在;且在規(guī)定的存儲條件下，隨著存放時間的增加，未對注射劑中蛋白的有無產(chǎn)生影響。

3.4 工藝中間體檢測結果 分別對五味藥材 (黃芩、金銀花、連翹、山羊角、熊膽粉)的工藝中間體，包括制備工藝各關鍵步驟提取物，進行了檢測，結果除金銀花和黃芩的水提液顯蛋白條帶外，其余藥材及后續(xù)工藝均未顯蛋白條帶。

分析各處方工藝可見，植物來源藥材水提液大多可見蛋白，但經(jīng)酸或堿沉淀后，蛋白消失不見，可以說明大生產(chǎn)中沉淀法可有效去除蛋白。至于兩味動物藥，山羊角為硫酸浸泡回流、熊膽粉回流液經(jīng)活性炭處理，經(jīng)過這些工藝步驟后，蛋白或被水解，或被吸附，故均未被檢測到。另外，每種處方提取工藝最后均經(jīng)超濾膜過濾，可有效去除大分子物質(zhì)。由此可見，沉淀、水解、活性炭吸附和超濾膜［11］過濾等工藝步驟，有助于去除藥材提取物中的蛋白，減小注射劑成品引入蛋白的可能性，有效保證中藥注射劑安全性。

同時，工藝中間體為實驗提供了陽性樣品參照，驗證了方法可行性，以處方黃芩和金銀花為例，酸堿沉淀前后，可明顯區(qū)別蛋白有無的實際情況，并可由對照品條帶初步推測水提液中蛋白分子量分布情況，見圖7。

圖7 工藝中間體凝膠電泳圖Fig.7 Electrophoresis of intermediates of Tanreqing Injection

4 討論

4.1 丙二醇等輔料對前處理方法的影響 中藥注射劑中除藥材提取成分對前處理造成干擾外，添加的輔料對前處理方法的選取也存在很大影響，如痰熱清注射液中，由于丙二醇黏度較大，在超濾過程中，造成超濾時間延長，且所得液體黏稠，無法繼續(xù)后續(xù)純化步驟。其他品種注射劑加聚山梨酯－80作助溶劑的情況普遍，該成分用超濾等方法均不能將其完全去除［12］，且干擾凝膠電泳顯色，進而影響檢測結果。通過對相關特征中藥注射劑品種進行研究，固相萃取結合沉淀法可最大限度去除輔料干擾，富集并純化蛋白質(zhì)，將前處理步驟造成蛋白的損失降到最小。

4.2 HLB柱應用于注射液中蛋白質(zhì)純化 由于痰熱清注射液成分復雜，單一的沉淀法或分離純化法富集除雜效果欠佳，因此實驗采用固相萃取結合沉淀法對蛋白富集除雜。

反相固相萃取法在蛋白前處理中通常起到富集作用，但由于中藥注射液中含有大量小分子物質(zhì)，這些成分在HLB柱上容易吸附，進而競爭蛋白吸附位點，導致蛋白無法在柱上保留或保留不強，因此采用常規(guī)思路難以富集蛋白。針對上述現(xiàn)象，實驗采用HLB柱作為除雜手段，以HLB柱吸附小分子雜質(zhì)，從而實現(xiàn)蛋白的純化，結合使用商品化沉淀試劑，可以完成對多處方、成分復雜的中藥注射液的前處理，建立適用性好、通用性強的蛋白檢測方法。

4.3 SDS-PAGE用于中藥注射劑蛋白檢測的優(yōu)勢 在分離復雜混合物中蛋白質(zhì)的常用方法中，聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前最可靠的方法之一。蛋白質(zhì)與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉 (SDS)按重量比結合成復合物，使蛋白質(zhì)分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質(zhì)分子的凈電荷，消除了不同蛋白質(zhì)分子的電荷效應，使蛋白質(zhì)按分子大小分離，其在目標物特異性和檢測抗干擾能力上有著其他方法難以比擬的優(yōu)勢。

也有文獻報道，中藥注射劑或中藥提取液中的蛋白采用基于顯色反應的比色法進行測定［13］。由于中藥注射劑背景顏色深，顯色法無法排除背景顏色的干擾，且靈敏度較低，無法獲得可靠結果，最終未采用該方法。實驗采用《中國藥典》2010年版一部附錄IX S有關物質(zhì)檢查法中磺基水楊酸沉淀法對痰熱清注射液加樣 (BSA)溶液進行檢測，結果顯示該方法的檢出限約為50 μg/mL，較本研究所建方法檢出限高約25倍。研究采用樣品加樣溶液檢出限與牛血清白蛋白對照品檢出限比較的方法對操作過程中蛋白的損失進行了考察，樣品加樣溶液凝膠電泳檢出限絕對值約為40 ng，牛血清白蛋白對照品檢出限絕對值約為35 ng，回收率約為87%。

實驗還曾嘗試UPLC-Q-TOF對注射劑中蛋白進行檢測，但由于反相色譜柱固定相的鍵合基團對蛋白的吸附性較強，導致大量蛋白黏附于鍵合碳上，導致蛋白質(zhì)響應會逐漸下降，另外由于蛋白質(zhì)分子量大，經(jīng)過質(zhì)核比計算轉化后，相比小分子靈敏度較差，會受到響應強的小分子雜質(zhì)干擾，故質(zhì)譜不適合大分子蛋白質(zhì)的直接測定。

凝膠電泳方法可更有效避免注射劑中大量小分子雜質(zhì)對微量蛋白檢測的干擾，具有檢測靈敏度高、結果直觀、方法易于普及的優(yōu)點。研究將其與適當前處理方法結合，可減少假陽性情況的發(fā)生，實現(xiàn)對注射劑中微量蛋白的檢測。

4.4 UPLC-Q-TOF的應用 隨著研究深入，也為了驗證凝膠電泳方法是否可以最大限度檢測出注射劑中微量蛋白，我們開發(fā)了結合目前蛋白檢測最前沿技術的方法，鎖定藥材提取物中特征蛋白，膠內(nèi)酶解后使用質(zhì)譜進行蛋白匹配，并篩選出特征肽段，用質(zhì)譜針對性檢測注射劑中肽段含量，結果為陰性。該方法檢測限與凝膠電泳方法接近，進一步證明凝膠電泳方法可靠，靈敏度達到微量檢測要求。后續(xù)研究仍在繼續(xù)中，依據(jù)此思路，不久將來可建立質(zhì)譜定量檢測注射劑中蛋白質(zhì)的方法。

4.5 方法對其他品種注射劑的適用性 本研究建立了固相萃取結合沉淀法分離富集、凝膠電泳檢測痰熱清注射液中微量蛋白的分析模式。為考察該模式對其他品種注射劑的適用性，實驗選取了生脈注射劑、黃芪注射劑等多個品種進行研究。結果表明，對于單方制劑、簡單的復方制劑以及工藝中間體，僅采用商品化沉淀試劑對樣品處理即可達到去除雜富集蛋白的目的，但對于痰熱清等成分復雜的注射劑品種，在使用沉淀試劑的同時需結合固相萃取法才可達到較好的除雜效果。因此，本研究建立的中藥注射劑中蛋白的檢測方法通用性較好，可為其他品種注射劑中蛋白的分析提供借鑒和參考。

5 結論

本實驗采用HLB柱結合沉淀試劑的方法對痰熱清注射液中微量蛋白分離富集，使用凝膠電泳銀染法檢測。與現(xiàn)行《中國藥典》方法比較，該方法有效解決了藥典方法中假陽性率高的問題，且靈敏度提高了25倍，更適宜于中藥注射液中蛋白質(zhì)的檢測。本研究為中藥注射劑中微量蛋白的檢測提供了研究思路，并為其他中藥注射劑品種建立蛋白質(zhì)檢測方法提供了參考依據(jù)，可有效保障中藥注射劑的用藥安全。

實驗在對注射劑中蛋白檢測的同時，增加了對工藝中間體中蛋白的研究，探尋工藝制法對蛋白的影響，有效指導制備工藝對蛋白存在的影響，從生產(chǎn)環(huán)節(jié)開始杜絕影響安全性物質(zhì)的存在。

［1］張文霞，鐘希文，曾聰彥.59例生脈注射劑不良反應文獻分析［J］.中國藥物警戒，2010，7(1):55-58.

［2］孫 端.中藥注射劑不良反應及預防［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2007，13(2):144-145.

［3］杜延琪，張 帆，龔文菲，等.茵梔黃注射劑的藥理作用及不良反應研究分析［J］.中藥材，2009，32(4):641-643.

［4］劉小豐，宋滄桑，張小青，等.清開靈注射劑致170例不良反應文獻分析［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2006，6(4):243-245.

［5］胡昌勤，許明哲，馬 越，等.含丹參的中藥注射液中過敏性雜質(zhì)的檢測［J］.藥學學報，2008，43(5):518-522.

［6］鄧道偉，明 華.痰熱清注射液臨床應用概況［J］.中國中醫(yī)急癥，2006，15(6):649-651.

［7］朱麗萍，蔡慶順.33例痰熱清注射液的不良反應文獻分析［J］.中成藥，2010，32(4):654-656.

［8］黃 宇，任皓威，劉 彪，等.離子交換色譜-基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜分離鑒定中國人乳中的β-酪蛋白［J］.色譜，2013，31(5):429-434.

［9］袁小軍，馬美湖，黃 群，等.兩步超濾法分離雞蛋清中卵轉鐵蛋白的研究［J］.食品與機械，2011，27(2):125-128.

［10］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版二部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄60.

［11］袁小軍，馬美湖，黃 群，等.超濾技術對中藥注射劑安全性和有效成分影響的研究進展［J］.中國藥房，2013，24(31):2972-2974.

［12］尹 楠，鄭云楓，彭國平，等.超濾技術應用對注射用輔料的影響研究［J］.中成藥2009，31(3):641-643.

［13］董 潔，郭立瑋，文紅梅，等.中藥水提液中蛋白質(zhì)含量測定方法研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2009，22(6):40-43.