一測多評法測定復方五仁醇膠囊中6種木脂素類成分

繆應祥，竇志華，陳 敏*，安莉萍

(1.南通大學附屬南通第三醫(yī)院，江蘇南通 226006;2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210046)

復方五仁醇膠囊是一種治療急慢性肝炎的科研制劑，由五味子、三七、柴胡、葉下珠四味藥組成，其中五味子為君藥［1］?，F(xiàn)代研究表明，五味子具有保肝、抗氧化等藥理作用［2］，其所含化學成分主要有木脂素類、萜類、有機酸類、糖類等［3］，木脂素類成分為其最主要的活性成分［4］。前期研究表明，復方五仁醇膠囊對肝細胞損傷具有明顯的保護作用［5］，保肝作用的藥效物質(zhì)基礎主要為五味子所含有的木脂素類成分［6］。一測多評法(quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS)，是指以樣品中某一典型組分為內(nèi)標，建立該組分與其他組分之間的相對校正因子 (relative correction factor，RCF)，通過相對校正因子計算其他組分的量，該法適用于對照品難得或制備成本高或不穩(wěn)定的情況下同類多成分的同時測定，已被《中國藥典》2010年版一部收錄［7］。本課題組前期已建立了HPLC法同時測定復方五仁醇膠囊中5種木脂素類成分的方法［8］，為了更方便、更全面控制和評價制劑質(zhì)量，本實驗建立了QAMS法同時測定該制劑中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6種木脂素類成分的量的方法。

1 材料

Waters Alliance高效液相色譜系統(tǒng)，包括e2695分離單元、2998二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站 (美國Waters公司);Shimadzu LC-2010CHT高效液相色譜儀，包括LC-2010CHT溶液傳輸單元、SIL-20A自動進樣器、紫外檢測器，LabSolutions色譜工作站 (日本島津公司);Sartorius BT 25S型電子天平 (德國賽多利斯公司)。乙腈 (國藥集團化學試劑有限公司，色譜純)，甲醇 (國藥集團化學試劑有限公司，色譜純)，純凈水 (杭州娃哈哈集團有限公司)。五味子醇甲 (批號110857-201211)、五味子酯甲 (批號111529-200604)、五味子甲素 (批號110764-201111)、五味子乙素 (批號1100765-200710)購自中國藥品生物制品檢定所，五味子醇乙 (批號20120517)、五味子丙素 (批號20120517)購自鼎瑞化工 (上海)有限公司。復方五仁醇膠囊(批號20130520)由南通大學附屬南通第三醫(yī)院提供。

2 方法與結果

2.1 HPLC定量方法

2.1.1 色譜條件 Lichrosphere C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相為乙腈 (A)-水(B)，梯度洗脫 (0～10 min，20% ～60%A;10～30 min，60%A;30～40 min，60% ～75%A;40～50 min，75% ～80% A)。體積流量 1.0 mL/min;柱溫30℃;檢測波長217 nm。以上條件下的樣品與對照品色譜圖見圖1。

圖1 復方五仁醇膠囊樣品 (A)與對照品 (B)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of sample(A)and reference substances(B)

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲4.50 mg、五味子乙素2.66 mg分別置10 mL量瓶中，五味子醇乙2.04 mg、五味子酯甲1.04 mg、五味子甲素1.21 mg、五味子丙素1.29 mg分別置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別配成6個對照品貯備液。精密吸取五味子醇甲、五味子乙素貯備液各1 mL，五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子丙素貯備液各0.5 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成混合對照品溶液。將上述對照品貯備液、混合對照品溶液于4℃保存，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取復方五仁醇膠囊內(nèi)容物約0.5 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇適量，浸泡30 min，超聲處理30 min，甲醇定容至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.1.4 線性關系考察 分別精密吸取混合對照品溶液1、3、6、9、12、15、18 μL進樣，測定其峰面積值，以峰面積Y對進樣量X(μg)進行回歸處理，得6種成分的回歸方程及線性范圍，見表1。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取批號為20130520的供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣測定6次，記錄五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的峰面積積分值，計算RSD，結果分別為0.2%、0.8%、4.2%、1.2%、0.2%和0.7%，表明儀器精密度良好。

表1 回歸方程及線性范圍Tab.1 Regression equation and linear range of reference substances

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取批號為20130520的供試品溶液10 μL，分別于制備后的0、3、6、9、12、24 h進樣測定，記錄五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的峰面積積分值，計算RSD，結果分別為1.4%、1.3%、5.9%、4.8%、2.1% 和 1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 取批號20130520的樣品，按“2.1.3”方法平行制備供試品溶液6份，進樣分析，計算得五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的平均質(zhì)量分數(shù)分別為 4.4339、1.2258、0.4112、0.8477、2.0152和0.2878 mg/g，RSD分別為0.5%、0.6%、5.0%、4.3%、0.6%、1.0%，表明該方法的重復性良好。

2.1.8 回收率試驗 稱取批號為20130520的復方五仁醇膠囊內(nèi)容物各約0.25 g 6份，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別精密添加一定量的五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素，按“2.1.3”項下方法制成供試品溶液，測定并計算各成分的加樣回收率以及RSD。結果見表2。

2.2 校正因子的計算 以五味子醇甲為內(nèi)參物，取多個質(zhì)量點計算所得的相對校正因子fs/i，取平均值作為定量用 fs/i。RCF 計算公式［9］:fs/i=(Ws×Ai)/(Wi×As)，其中As為內(nèi)參物峰面積，Ws為內(nèi)參物質(zhì)量，Ai為某待測組分i峰面積，Wi為某待測組分i質(zhì)量。計算待測組分五味子醇乙(B)、五味子酯甲 (C)、五味子甲素 (D)、五味子乙素 (E)和五味子丙素 (F)與內(nèi)參物五味子醇甲 (A)的相對校正因子。結果見表3。

表2 加樣回收率試驗結果Tab.2 Results of recovery tests

表3 復方五仁醇膠囊中木脂素類成分的相對校正因子Tab.3 Relative correction factors(RCF)of lignanoids in CWC

2.3 校正因子的重現(xiàn)性考察 精密吸取混合對照品溶液10 μL，進樣分析，在兩個實驗室分別考察了Waters、Shimadzu兩種高效液相色譜系統(tǒng)和Symmetry C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Lichrosphere C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)兩種色譜柱對相對校正因子的影響，結果RSD均小于5%，表明在不同實驗室、不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱下具有良好的重現(xiàn)性。結果見表4。

2.4 待測組分色譜峰的定位 色譜峰的準確定位一般可以采用保留時間差或相對保留值等參數(shù)結合色譜圖整體特征，以及每個峰的紫外吸收特征來定位其余待測成分色譜峰［10］。本研究考察了相對保留值 (ri/s=tRi/tRs)和保留時間差 (△ti/s=tRitRs)兩種參數(shù)在兩種高效液相色譜儀和兩種不同型號色譜柱中的重現(xiàn)性，結果表明各待測成分相對保留值RSD均小于5%，而保留時間差均大于10%，即保留時間差值變化范圍大，不宜采用，相對保留值數(shù)值穩(wěn)定，可以用于待測成分色譜峰的定位。結果見表5。

表4 不同儀器和色譜柱測定相對校正因子Tab.4 RCFs with different instruments and columns

表5 不同儀器和色譜柱測定的相對保留值和保留時間差值Tab.5 Relative retention values and differences in retention time determined with different instruments and different columns

2.5 “一測多評法”與外標法測定結果的比較分別精密吸取10個批號供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測定。采用外標法測定五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素的量，同時用建立的QAMS法進行成分定量計算，并以相對誤差為參數(shù)對兩種方法所得結果進行比較［11］，結果表明，相對誤差均小于4%，提示建立的方法具有較好的可信度。見表6。

表6 一測多評法與外標法測定復方五仁醇膠囊中木脂素類成分的結果比較Tab.6 Comparison of contents of lignanoids in CWC by external standard method and QAMS

3 討論

3.1 實驗過程中考察了甲醇和乙醇對6種木脂素的提取率，結果表明前者優(yōu)于后者;考察了甲醇超聲和回流兩種提取方法對6種木脂素的提取率，結果表明后者優(yōu)于前者;考察了甲醇回流提取30 min、45 min和60 min的提取率，結果表明回流30 min有4種木脂素的提取率大于時間為60 min，6種木脂素的提取率均大于45 min。故提取方法最終確定為甲醇回流30 min。

3.2 考察了甲醇-水和乙腈-水兩種流動相系統(tǒng)的分離效果，結果表明后者優(yōu)于前者，故確定乙腈-水作為流動相。

3.3 《中國藥典》指定五味子醇甲為五味子指標成分，且該成分在五味子中含有量最高，對照品易得，故選擇五味子醇甲為內(nèi)參物。

3.4 耐用性考察 本研究考察了2種不同高效液相色譜儀和2種不同品牌色譜柱對五味子木脂素類成分相對校正因子的影響，結果發(fā)現(xiàn)各成分相對校正因子重現(xiàn)性良好 (RSD＜5%)。

3.5 結論 在中藥多指標質(zhì)量評價過程中，多采用指紋圖譜技術來體現(xiàn)中藥的整體性，但它太過模糊的特點造成了在實際生產(chǎn)、監(jiān)督中的應用難度和“難以說清楚”的局面［12］。一測多評法建立的目的就是采用僅測定一個成分，從而實現(xiàn)多成分同步測定的模式，克服多指標質(zhì)量控制面臨的對照品短缺和高昂檢測成本問題［13］。本實驗的研究結論表明，一測多評所得成分含有量的計算值與傳統(tǒng)的外標法所得實測值之間沒有顯著性差異，不同實驗條件下各成分間的校正因子重現(xiàn)性良好。由此表明在對照品缺乏的前提下，一測多評法可以作為一種方便、快捷、準確的方法應用于復方五仁醇的質(zhì)量評價?！耙粶y多評”法將是中藥多組分同步定量的發(fā)展方向［14］，也是《中國藥典》2015年版品種修訂中重點推廣的技術［15］。

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