大承氣湯傳統(tǒng)煎煮工藝的優(yōu)化

謝瑞芳，石志娜，2，李毅民，周 昕*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥劑科，上海 200032;2.河北省邢臺市第三醫(yī)院藥劑科，河北 刑臺 054000)

大承氣湯出自張仲景的《傷寒論》，是治療陽明腑實(shí)證的主要方劑，處方由大黃、厚樸、枳實(shí)、芒硝組成。主治潮熱澹語，手足戳然汗出，腹?jié)M硬痛，大便不通，脈沉遲有力;或發(fā)則不識人，循衣摸床，微喘直視;或目中不了了，睛不和;或陽明病，發(fā)熱汗多;或發(fā)汗不解，腹?jié)M痛等［1］。其主要功用是通過通便達(dá)到瀉熱的目的，尤其適用于因發(fā)熱耗傷津液所造成的大便燥結(jié)性腸梗阻或不完全性腸梗阻［2］。

作為傳統(tǒng)經(jīng)方，相關(guān)研究報道十分多［3-4］，其臨床療效優(yōu)良、副作用少且價格相對低廉，得到了醫(yī)生和患者的一致認(rèn)可。由于傳統(tǒng)湯劑中有效成分的量受到煎煮過程中藥材浸泡時間、煎煮時間、加水量、煎煮次數(shù)等因素的影響，一般病人服藥均按經(jīng)驗(yàn)煎煮，各因素沒有固定的參數(shù)控制，使有效成分含有量參差不齊，難以達(dá)到最佳療效［5-6］。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HPLC法測定大承氣湯中各有效成分的量并以各有效成分量的綜合評分值為考察指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面分析統(tǒng)計方法，篩選出顯著影響因素并確定最佳水平組合，優(yōu)化了大承氣湯的人工煎煮工藝，闡明了煎煮過程中影響因素對大承氣湯中有效成分的影響。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀 (德國Agilent公司);XW-80A旋渦混合器 (上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);SB2200超聲儀 (上海必能超聲儀器公司);Sartorius BS110S精密電子天平。

1.2 試劑 橙皮苷 (批號110721-200613)、大黃素 (批號110756-200110)、大黃酚 (批號110796-201017)、大黃素甲醚 (批號110758-200912)等對照品購自中國食品藥品檢定研究院 (純度 ＞99%)。HPLC級甲醇購自Merk公司 (德國)，水為純化水，由Milli-Q水處理系統(tǒng)處理 (Millipore，Bedford，MA，USA)，其他試劑為分析純，購自上海吳涇化工廠。生大黃 (批號LY2010040340，產(chǎn)地甘肅)、厚樸 (批號110124，產(chǎn)地四川)、枳實(shí)(批號100901，產(chǎn)地四川)均購自上海萬仕誠國藥制品有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及樣品溶液的制備

2.1.1 色譜條件 C18518905-902色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);以甲醇為流動相A，0.1%磷酸水為流動相B，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫條件如表1所示;體積流量為1 mL/min;柱溫25℃;檢測波長294 nm;進(jìn)樣量10 μL;檢測時間75 min。

表1 大承氣湯色譜條件Tab.1 Chromatographic conditions for Dachengqi Decoction

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷2.80 mg、蘆薈大黃素0.50 mg、大黃酸0.70 mg、大黃素0.40 mg、厚樸酚2.00 mg及和厚樸酚1.30 mg于10 mL量瓶中，用甲醇定容，然后稀釋至不同質(zhì)量濃度，0.22 μm微孔濾膜濾過，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 量取大承氣湯合煎液2 mL于10 mL量瓶中，加甲醇約至刻度線，超聲提取20 min，冷卻至室溫，補(bǔ)充溶劑至刻度，搖勻，靜置過夜后，取上清液，10000 r/min，離心10 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2 方法學(xué)研究

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 精密吸取橙皮苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、厚樸酚及和厚樸酚不同質(zhì)量濃度的對照品溶液注入色譜儀，進(jìn)樣量為5 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明 (表2)，相關(guān)系數(shù)均大于0.9995，線性關(guān)系良好。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定Tab.2 Establishment of calibration curves

2.2.2 精密度及加樣回收率試驗(yàn) 取同一份大承氣湯，按高、中、低劑量分別加入橙皮苷、蘆薈大黃素、和厚樸酚、厚樸酚、大黃素和番瀉葉苷A對照品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下的處理得供試品溶液，連續(xù)3 d各測定3次，每次進(jìn)樣量為10 μL，記錄峰面積，計算回收率、日間及日內(nèi)精密度。在信噪比 (S/N)為3和10時，分別測定各對照品的最低檢測限 (LOD)及最低定量限 (LOQ)。

結(jié)果表明，各指標(biāo)成分的日內(nèi)及日間RSD均小于3.50%，表明該方法精密度良好。最低檢測限和定量限均能滿足樣品測定的要求。橙皮苷回收率為89.98% ～100.52%，蘆薈大黃素回收率為99.52%～109.96%，和厚樸酚回收率為93.36%～107.47%，厚樸酚回收率為105.44% ～107.47%，大黃素回收率為93.73%～117.90%，番瀉葉苷A回收率為95.1%～113.9%，表明回收率良好，見表3。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份大承氣湯煎液的供試品溶液，在0、2、4、24、48 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，計算RSD，考察色譜條件的穩(wěn)定性。

結(jié)果表明，供試品主要指標(biāo)成分保留時間的RSD在0.01%～0.18%之間，相對峰面積的RSD在1.41%～9.26%之間，表明該試驗(yàn)方法在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 選取大承氣湯合煎液 (批號Box1)2 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下藥液處理方法平行處理3份樣品，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10 μL，考察方法重復(fù)性。

結(jié)果表明，主要指標(biāo)成分相對保留時間的RSD在0.05%～0.68%之間，相對峰面積的RSD在1.79%～15.80%之間，表明該方法重復(fù)性尚可，見表4。

表3 指標(biāo)成分精密度，加樣回收率，最低檢測限和定量限 ()Tab.3 Precison，recovery，LOD and LQD of chemical structures()

表3 指標(biāo)成分精密度，加樣回收率，最低檢測限和定量限 ()Tab.3 Precison，recovery，LOD and LQD of chemical structures()

化學(xué)成分 對照品平均加入量/μg回收率/%.98橙皮苷 7.924 15.334±0.072 0.47 15.672±0.298 1.90 95.21 5 99.509 17.356±0.126 0.72 17.679±0.318 1.80 100.521.100 3.713±0.078 2.10 3.784±0.076 2.01 109.83蘆薈大黃素 1.250 3.769±0.040 1.05 3.806±0.073 1.92 109.96 16 301.600 4.287±0.147 3.42 4.320±0.112 2.59 99.525.500 3.553±0.016 0.44 3.630±0.070 1.93 105.44和厚樸酚 7.160 3.948±0.015 0.39 3.998±0.050 1.25 107.47 4 1112.200 4.667±0.060 1.30 4.751±0.080 1.68 93.365.500 3.553±0.016 0.44 3.630±0.070 1.93 105.44厚樸酚 5.500 3.553±0.016 0.44 3.630±0.070 1.93 105.44 7 207.160 3.948±0.015 0.39 3.998±0.050 1.25 107.472.554 5.547±0.066 1.20 5.611±0.060 0.01 93.73大黃素 3.192 6.540±0.101 1.54 6.528±0.081 1.24 104.66 2 53.830 7.721±0.120 1.55 7.699±0.083 1.07 117.903.530 7.832±0.061 0.78 7.725±0.097 1.26 95.1番瀉葉苷 A 4.412 9.035±0.093 1.03 9.041±0.069 0.77 104.9 30 555.294 10.354±0.159 1.53 10.504±0.166 1.58 113.9/ng 6.339 13.517±0.020 0.15 13.815±0.300 2.17 89日內(nèi)精密度(n=3)測量值 /μg RSD/%日間精密度(n=3)測量值/μg RSD/%(n=9) LOD/ng LOQ

表4 大承氣湯煎液重復(fù)性Tab.4 Reproducibility of Dachengqi Decoction

2.3 綜合評分及各成分權(quán)重系數(shù)的確定 AHP法根據(jù)大承氣湯中有效成分HPLC檢測信息及色澤、相對密度、干浸膏得率信息，將其25個色譜峰、最大吸光度值、相對密度和干浸膏得率作為權(quán)重的指標(biāo)，分為五層次:其中 A18(蘆薈大黃素)、A20(大黃酸)、A24(大黃素)、A25(番瀉葉苷A)為君藥大黃定量測定成分，且起到主要瀉下作用，為第一層次;A9(橙皮苷)、A19(和厚樸酚)、A22(厚樸酚)為厚樸和枳實(shí)藥材主要成分，輔助瀉下，為第二層次;A8、A10為最大的未知峰作為第三層次;A1、A5、A6、A7、A13、A14、A15為較大的未知峰和最大吸光度值、相對密度、干浸膏得率作為第四層次;其他未知峰A2、A3、A4、A11、A12、A16、A17、A21、A23、A26 峰面積均較小作為第五層次。因此這幾項(xiàng)指標(biāo)依次評分為7、5、3、2、1。參照文獻(xiàn) ［7］構(gòu)成成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，并獲得各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。CRITIC法根據(jù)實(shí)測峰面積值間的相似度計算各色譜峰的權(quán)重系數(shù)。

參照文獻(xiàn) ［8］采用綜合評分法，按照公式⑤將AHP法計算的權(quán)重系數(shù)與CRITIC法計算的權(quán)重系數(shù)加權(quán)得到綜合權(quán)重。

ωAHP表示AHP法計算的權(quán)重系數(shù)，ωCRITIC表示CRITIC法計算的權(quán)重系數(shù)，i表示第i個因素，j表示第j個樣本。

經(jīng)研究，大黃中瀉下的主要有效成分為番瀉葉苷以及大黃素甲醚葡萄糖苷、大黃酚葡萄糖苷、大黃素葡萄糖苷等結(jié)合型蒽醌苷類，它們可通過消化道達(dá)到大腸，再經(jīng)酶或細(xì)菌分解為苷元，刺激大腸，增強(qiáng)腸蠕動，減少水分吸收而具有瀉下作用;而大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸和大黃素甲醚等游離型蒽醌由于經(jīng)消化道氧化，作用減弱，瀉下作用很小［9］。加熱時間越長，溫度越高，結(jié)合型蒽醌就越易水解轉(zhuǎn)化為游離型蒽醌，瀉下作用就越弱;而大黃中鞣質(zhì)由于較穩(wěn)定，加熱和高溫反而增加了一些吸收功能，增加了止瀉和止血功能。

指紋圖譜中測定到大黃的指標(biāo)成分多為大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚等游離型蒽醌具有抗菌作用，但不具有瀉下作用，且含有量越高，說明結(jié)合型蒽醌成分破壞多，因此在進(jìn)行綜合評分時，定為負(fù)值。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn) 此方法既能考察各個影響因素對大承氣湯有效成分綜合評分值的影響，也能進(jìn)行各個因素的最優(yōu)化，建立數(shù)學(xué)模型并作出相應(yīng)的三維應(yīng)變量曲面圖，對因素與指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行直觀的量化分析［10-11］。

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計因子的水平范圍的規(guī)定預(yù)初實(shí)驗(yàn)的結(jié)果初步確定煎煮次數(shù)為3次，在本次實(shí)驗(yàn)設(shè)計中選用浸泡時間 (X1)、煎煮時間 (X2)、加水量 (X3)為因素 (設(shè)計因素水平見表5)，以綜合評分為效應(yīng)進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計－效應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并采用Design Expert 7.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析。

表5 Box-Behnken設(shè)計因素水平及編碼Tab.5 Parameters and levels for Box-Bhehnken

按照Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計的統(tǒng)計學(xué)要求，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ屯ㄟ^最小二乘法擬合二次多項(xiàng)式方程可以表述，Xi、Xj(i=1、2、3;i≠j)為自變量真實(shí)值。多項(xiàng)式模型方程擬合的性質(zhì)由確定系數(shù)R2表達(dá)，其統(tǒng)計學(xué)上的顯著性由F值檢驗(yàn);采用Design Expert 7.0軟件分析。

2.4.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果 3個因素17個試驗(yàn)，按照Box-Behnken設(shè)計表進(jìn)行試驗(yàn)，每個試驗(yàn)號做3次重復(fù)，綜合評分測定結(jié)果取3次的平均值。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及響應(yīng)值 (綜合評分)見表6(第13～17次實(shí)驗(yàn)為5次重復(fù)的中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，用于考察模型的誤差)。

其F值檢驗(yàn)顯示總模型方程顯著 (P=0.012)，R2=0.8925，失擬性檢驗(yàn)不顯著 (P=0.7634)，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準(zhǔn)確的預(yù)測實(shí)際情況。其校正決定系數(shù)=0.7543，表明75.43%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型來解釋，實(shí)驗(yàn)過程中存在一定的誤差，大約有25%不能由此模型進(jìn)行解釋，回歸方程為(Y為綜合評分，X1為浸泡時間，X2為煎煮時間，X3為加水量)。

表6 Box-Behnken設(shè)計及綜合評分Tab.6 Results of Box-Bhehnken design

根據(jù)回歸分析結(jié)果，作出響應(yīng)曲面圖，見圖1～3。加水量較浸泡時間和煎煮時間對綜合評分的影響更大，煎煮時間和加水量有一定的交互作用。從圖可以看出，隨著浸泡時間和煎煮時間的延長，綜合評分值逐漸下降，但趨勢不明顯;隨著加水量的增加，綜合評分值先增大后減小，當(dāng)加水量為7～9倍時，綜合評分值相對最高。綜上所述，當(dāng)浸泡時間在30～40 min，煎煮時間在35～45 min，加水量為7～9倍變動時，綜合評分值相對較高。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 為了確定建立模型與試驗(yàn)結(jié)果是否相符，需要進(jìn)一步試驗(yàn)對模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。在驗(yàn)證試驗(yàn)中，各因素取值在浸泡時間30～40 min，煎煮時間35～45 min，加水量7～9倍(取整數(shù)進(jìn)行組合，其中時間間隔為5 min)進(jìn)行組合，共有27種組合，按照綜合評分的方程計算綜合評分的預(yù)測值，評分最高的前9組進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，具體安排見表7。所得的藥液，濾過，合并煎液，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。按照第一部分“2.1.3”項(xiàng)下處理樣品，得供試品溶液，注入高效液相色譜儀。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定各指標(biāo)成分含量。按照各指標(biāo)成分的回歸方程 (表2)，計算預(yù)測值，并與實(shí)測值相比較。

圖1 煎煮時間和浸泡時間對綜合評分影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Parameter-effect figure of synthetic values for decocting and soaking time

圖2 加水量和浸泡時間對綜合評分影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Parameter-effect figure of synthetic values for water volume and soaking time

結(jié)果表明 (表8):在9次驗(yàn)證試驗(yàn)中，第6次試驗(yàn)的厚樸酚、大黃素實(shí)測值與預(yù)測值的差異差異最小，其他指標(biāo)成分的量差異也不大。故在較優(yōu)組合中相對最優(yōu)的工藝條件為第6次試驗(yàn)條件，即浸泡時間40 min，煎煮時間40 min，加水量9倍。

圖3 加水量和煎煮時間對綜合評分影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Parameter-effect figure of synthetic values for water volume and decocting time

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)安排Tab.7 Verifying test schedule

3 結(jié)論

由上可知，大承氣湯傳統(tǒng)煎煮最佳工藝如下:藥材飲片加9倍量水浸泡40 min后，厚樸和枳實(shí)煎煮35 min，再加入浸泡過的大黃繼續(xù)煎煮5 min，煎煮液過濾備用，藥渣再加7倍量水煎煮2次，每次40 min，合并3次煎液，濃縮，加入芒硝溶化。

4 討論

國內(nèi)文獻(xiàn)報道工藝研究一般采用均勻設(shè)計和正交設(shè)計的方法選擇較佳工藝，由于試驗(yàn)次數(shù)少，數(shù)據(jù)處理和操作都比較方便，其應(yīng)用已經(jīng)達(dá)到了普及，然而這兩種方法的應(yīng)用存在著一定的誤區(qū)，它們是基于線性模型設(shè)計的方法，而事實(shí)上影響因素與效應(yīng)值之間又是可能不是線性關(guān)系，若忽略這種情況簡單進(jìn)行線性模型設(shè)計，就會在很大程度上與真實(shí)值發(fā)生偏差，而效應(yīng)面法應(yīng)用效應(yīng)面曲面模型進(jìn)行分析，基于非線性模式進(jìn)行設(shè)計和研究，比較合理［12-13］。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)測定結(jié)果Tab.8 Contents results of verifying test

本實(shí)驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計，充分考慮到各影響因素間交互作用，設(shè)計方法簡單，試驗(yàn)次數(shù)少，在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)以提高試驗(yàn)精度，同時采用非線性擬合可信度好，預(yù)測值與真實(shí)值更接近，結(jié)果比均勻設(shè)計、正交設(shè)計更直觀，便于分析。

大承氣湯傳統(tǒng)煎煮過程中，藥材浸泡時間、煎煮時間、加水量等因素沒有固定的參數(shù)控制，導(dǎo)致所煎出的湯劑有效成分的量參差不齊，藥效相差甚遠(yuǎn)。本實(shí)驗(yàn)以大承氣湯有效成分綜合評分值為評價指標(biāo)，對其人工煎煮工藝進(jìn)行研究，量化了各個影響因素的參數(shù)，確定了最佳煎煮工藝路線，為使大承氣湯成為煎煮工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控、療效確切的中藥湯劑奠定了基礎(chǔ)。

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