葉酸偶聯(lián)載多西紫杉醇?xì)ぞ厶羌{米粒包封率的測(cè)定

汪小樂(lè) 鄧燕芬 龐廷媛 程國(guó)華

多西紫杉醇(DTX)是一種半合成的紫杉烷類抗腫瘤藥物，抗癌活性比紫杉醇較高。其作用機(jī)制是增強(qiáng)微管蛋白聚合并抑制微管解聚，導(dǎo)致形成穩(wěn)定的非功能性維管束，破壞有絲分裂和細(xì)胞增殖，是現(xiàn)有藥物中治療轉(zhuǎn)移乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌最有效的單劑化療藥物［1］。目前國(guó)內(nèi)上市的劑型為注射液，因處方中含有大量非離子表面活性劑吐溫－80和增溶劑無(wú)水乙醇，常常導(dǎo)致臨床嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。同時(shí)，由于藥物的分布無(wú)選擇性，易導(dǎo)致中性粒細(xì)胞減少、神經(jīng)毒性等毒副作用［2］。為降低其毒副作用，提高制劑的腫瘤靶向性和臨床療效，本試驗(yàn)將DTX制備成葉酸偶聯(lián)載多西紫杉醇?xì)ぞ厶羌{米粒，并采用離心法分離載藥納米粒中的游離藥物，以高效液相色譜法測(cè)定DTX的含量及包封率，并進(jìn)行方法學(xué)考察。

1 儀器與材料

BT125D Sartorius電子天平(賽多利斯天平有限公司);RW20DZM.n強(qiáng)力流線型攪拌機(jī)(IKA，德國(guó));LC－20AT型高效液相色譜儀配SPD－20A型檢測(cè)器;LCsolution色譜工作站;CENTRIFUGE5424離心機(jī)(eppndorf)。

殼聚糖(DAC degree≥ 95%，分子量161.16 KDa);多西紫杉醇(DTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):626111003，含量101.0%);多西紫杉醇對(duì)照品(恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):26070904，含量99.0%);N－羥基丁二酰亞胺(NHS，成都市科龍化工試劑廠，批號(hào):20110201);N，N'－二環(huán)己基碳二亞胺(DCC，阿拉丁，批號(hào):48623);葉酸(FA，科龍化工試劑廠，批號(hào):20101001，含量≥97.0%);無(wú)水二甲基亞砜(DMSO);其余試劑均未分析純，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 FA－CTS/DTX納米粒及空白FA－CTS納米粒的制備

2.1.1 葉酸活性酯的制備 稱取FA 0.3 g、DCC 0.282 g、NHS 0.156 g，溶于10 ml無(wú)水DMSO中，室溫避光反應(yīng)過(guò)夜，過(guò)濾除去反應(yīng)副產(chǎn)物二環(huán)己基脲，濾液在攪拌下中逐滴滴入冰冷的含30%丙酮的無(wú)水乙醚溶液中，得黃色沉淀物，再用無(wú)水乙醚洗2遍，真空干燥，得葉酸活性酯。

2.1.2 葉酸偶聯(lián)殼聚糖的制備 稱取殼聚糖20 mg，溶于5 ml醋酸－醋酸鈉緩沖液中，磁力攪拌下緩慢加入1 ml葉酸活性酯的DMSO溶液(20 mg/ml)，30℃下避光反應(yīng)16 h后，調(diào)節(jié)溶液pH至9.0。將沉淀出的葉酸偶聯(lián)殼聚糖用蒸餾水洗滌數(shù)遍后，重新溶于1%醋酸溶液，然后通過(guò)SepHadex G－10凝膠柱進(jìn)行分離，除去尚未反應(yīng)的游離葉酸。洗脫液為1%醋酸溶液，流速1.5 ml/min。運(yùn)用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在363 nm處監(jiān)測(cè)洗脫過(guò)程，收集第一個(gè)流出的峰，冷凍干燥后備用［3］。

2.1.3 FA－CTS/DTX納米粒的制備 將FA－CTS凍干粉末溶于1%醋酸溶液中得3 mg/ml FA－CTS溶液。稱取0.5 mg DTX粉末溶于適量無(wú)水乙醇中，超聲至完全溶解，形成多西他賽無(wú)水乙醇溶液。將兩者混合，持續(xù)磁力攪拌下，緩慢加入2 mg/ml STPP溶液，磁力攪拌30 min，得到FA－CTS/DTX納米粒。按同樣反應(yīng)條件，制備不加DTX的空白FA－CTS納米粒。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 － 水(67∶33);流速:1.0 ml/min;柱溫:40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):229 nm;進(jìn)樣量:10 μl。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取DTX對(duì)照品5.0 mg，加入無(wú)水乙醇溶解定容至10 ml量瓶，得濃度為0.5 mg/ml的DTX儲(chǔ)備液。精密移取該儲(chǔ)備液，配置成0.1、0.5、1.0、1.5、15.0 μg/ml的對(duì)照品溶液。分別取上述對(duì)照液10 μl進(jìn)樣，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以DTX質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程:Y=26 392X+1 147.5，r=0.999 9。多西紫杉醇濃度在 0.1 ～15.0 μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下0.1、1.0、15.0 μg/ml三種質(zhì)量濃度對(duì)照液分別重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD分別為1.67%、0.14%、0.12%。表明本方法精密度良好。

2.2.4 回收率試驗(yàn) 取 2.2.2項(xiàng)下 DTX儲(chǔ)備液(0.5 mg/ml)，分別精密移取 0.8、1.0、1.2 ml置于 10 ml容量瓶中，各加入空白FA－CTS納米粒1 ml，用無(wú)水乙醇定容至10 ml，搖勻，超聲后，5 000 r/min離心3 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜后進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算主藥含量，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表 1?？偲骄厥章蕿?7.73%，RSD為0.71%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5 樣品含量測(cè)定 精密量取FA－CTS/DTX納米粒1.0 ml，加無(wú)水乙醇定容于10 ml容量瓶，搖勻，超聲后，5 000 r/min離心3 min，取上清液過(guò)0.45 μm濾膜，分別平行制備3分。分別取10 μl進(jìn)樣分析，按外標(biāo)法計(jì)算DTX含量。測(cè)得樣品平均含量為0.496 5 mg。

2.3 離心法測(cè)定包封率

2.3.1 回收率試驗(yàn) 精密吸取FA－CTS/DTX納米粒樣品0.4、0.45和0.475 ml于3個(gè)1.5 ml EP管中，加入等體積的DTX儲(chǔ)備液，稀釋至1.5 ml，混勻，得終濃度分別為0.26、0.30和0.32 mg/ml，分別平行制備3份。移取500 μl上述混合溶液分別于3 000 r/min離心10 min，再分別移取等量上清液至10 ml容量瓶中，稀釋至刻度線，搖勻;沉淀也依次用稀釋定容至10 ml容量瓶，搖勻，分別測(cè)得上清液和沉淀的主藥含量，即得0.26、0.30和0.32 mg/ml三個(gè)濃度離心后的主藥含量。移取500 μl上述混合溶液至10 ml容量瓶中，稀釋至刻度線，搖勻，即得3個(gè)濃度未經(jīng)離心處理的總藥溶液。按2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算主藥含量，并計(jì)算其回收率。3種濃度的平均回收率分別為101.48%、100.89%和100.92%，總體平均回收率為101.10%，RSD為2.06%。見(jiàn)表2。

表2 FA－CTS/DTX納米?；厥章?(mg/ml)

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取FA－CTS/DTX納米粒樣品適量于6個(gè)1.5 ml EP管中，加入一定量的DTX儲(chǔ)備液，充分混勻，得終濃度為0.30 mg/ml，分別于 3 000 r/min離心10 min，再分別移取等量上清液至10 ml容量瓶，稀釋至刻度線，搖勻，按2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算主藥含量，即得被包封藥物含量;同時(shí)制備未經(jīng)離心處理的樣品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算主藥含量，即得總藥含量。結(jié)果FA－CTS/DTX納米粒平均包封率為83.74%，RSD為1.3%，離心法測(cè)定包封率的重復(fù)性良好。

2.3.3 包封率的測(cè)定 精密移取適量FA－CTS/DTX納米粒于1.5 ml EP管中，3 000 r/min離心10 min，精密吸取上清液及未經(jīng)離心處理的納米粒溶液適量，按含量測(cè)定方法分別測(cè)定其含量，即得包封藥物含量(W包)和納米?？偹幒?W總)，按公式計(jì)算包封率，包封率=(W包/W總)×100%。3批樣品的包封率分別為86.12%、85.94%和85.16%。

3 討論

包封率是評(píng)價(jià)納米粒制備工藝的重要指標(biāo)，也是納米粒能否發(fā)揮較普通制劑高效、低毒特點(diǎn)并提高藥物治療效果、降低藥物毒副作用并減少藥物劑量的關(guān)鍵。納米粒包封率測(cè)定的常用方法有葡聚糖凝膠過(guò)濾法、超速離心法、微柱離心法［4］、透析法及超濾法等。筆者曾嘗試用葡聚糖凝膠過(guò)濾法和透析法分離FA－CTS/DTX納米粒中的游離藥物，結(jié)果表明凝膠過(guò)濾法的分離效果與納米粒粒徑有關(guān)，粒徑大的粒子柱內(nèi)通路較短，色譜保留性能較弱，載藥納米粒與游離藥物的分離度不好，樣品回收率和包封率較低［5］。而多西紫杉醇為脂溶性藥物，其在水中溶解度較小，需要較長(zhǎng)的透析時(shí)間和很大的透析液體，導(dǎo)致游離的藥物難以定量檢測(cè)。

采用低速離心法［6］分離納米粒和游離藥物，具有操作簡(jiǎn)便、儀器要求低等優(yōu)點(diǎn)。該方法的關(guān)鍵在于離心強(qiáng)度選擇，離心強(qiáng)度過(guò)小導(dǎo)致藥物沉降不完全，過(guò)大則會(huì)將載藥納米粒沉淀下來(lái)，難以達(dá)到分離目的。多西紫杉醇不溶于水，游離的多西紫杉醇大部分以晶體形式析出，本試驗(yàn)采用3 000 r/min離心10 min的條件可將載藥納米粒與游離藥物有效分離，方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法可行，測(cè)得FACTS/DTX納米粒的平均包封率為85.74%。

［1］梁曉麗，夏路風(fēng)，劉鳳琴.多西紫杉醇的藥理與臨床應(yīng)用［J］.首都醫(yī)藥，1999(5):28－29.

［2］饒 媚，郭麗珍，賴劍鋒，賴小平.含紫杉醇聯(lián)合方案引起肝功能異常的臨床分析［J］.現(xiàn)代醫(yī)院，2013，13(10):5 －7.

［3］WARD C M，ACHESON N，SEYMOUR L W.Folic acid targeting of protein conjugates into ascites tumour cells from ovarian cancer patients［J］.J Drug Target，2000，8(2):119 － 123.

［4］崔 騰，郭偉英.微柱離心－HPLC法測(cè)定卡培他濱脂質(zhì)體包封率［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012(8):682 －684.

［5］趙 鋒，欒瀚森，羅華菲，等.葡聚糖凝膠色譜法用于納米粒包封率的測(cè)定［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2012(17):1385－1390.

［6］王永利，王立華，夏明華，等.低速離心法測(cè)定大黃酚脂質(zhì)體包封率［J］.河北北方學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2012(6):30－32，35.