高爾基體膜蛋白73在原發(fā)性肝癌患者血清中的表達(dá)及其早期診斷價(jià)值

陳海波， 顧玉明， 王 洵

原發(fā)性肝癌（PHC）早期診斷率低。尋找特異性更高、更靈敏的腫瘤標(biāo)志物和實(shí)驗(yàn)室診斷方法是研究 PHC 的重要方向［1］。 GP73（Golgi protein-73），主要表達(dá)于人類多種組織的上皮細(xì)胞，肝細(xì)胞不表達(dá)或很少表達(dá)，而后大量研究表明：血清中GP73水平高低與PHC關(guān)系密切，在PHC檢測(cè)的靈敏度和特異度上均遠(yuǎn)高于AFP，有望成為原發(fā)性肝癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物［2-3］。

臨床中，布加綜合征 （BCS）合并肝細(xì)胞癌（HCC）并不少見［4-5］，二者合并發(fā)生的具體機(jī)制尚不清楚。

本研究以肝臟疾病、BCS合并HCC患者及健康志愿者為研究對(duì)象，應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法和ELISA方法檢測(cè)各組血清中AFP值和GP73的表達(dá)水平，分別計(jì)算診斷的曲線下面積、靈敏度、特異度及正確率，探討GP73對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2013年3月—2014年1月在徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的患者及健康志愿者490例。其中：① HCC 65例，男55例、女10例，年齡41～78歲，平均52歲。通過穿刺活檢、手術(shù)后病理學(xué)、DSA、B型超聲、CT中的1種或多種手段證實(shí)［6］。② 膽管細(xì)胞肝癌35例，男25例，女10例，年齡40～75歲，平均53歲。符合參考文獻(xiàn)［7］的診斷標(biāo)準(zhǔn)。③ BCS合并HCC 40例，男36例，女4例，年齡35～58歲，平均43歲。根據(jù)臨床表現(xiàn)、肝功能、腫瘤標(biāo)志物、超聲、肝靜脈及下腔靜脈MRV、DSA造影及肝臟穿刺活檢等綜合確診。④乙型病毒性肝炎（乙肝）60例，男40例、女20例，年齡20～69歲，平均39歲。符合乙肝診斷標(biāo)準(zhǔn)（2010年版）［8］。 ⑤ 乙肝肝硬化60例，男39例、女21例，年齡20～70歲，平均51歲。在排除肝占位性病變后，根據(jù)臨床表現(xiàn)、肝功能指標(biāo)檢測(cè)和B型超聲檢查等確診。⑥BCS合并肝硬化60例，男45例、女15例。年齡20～70歲，平均47歲。根據(jù)臨床表現(xiàn)、肝功能、B型超聲、肝靜脈及下腔靜脈MRV、DSA造影等綜合確診。⑦其他惡性腫瘤50例（胃癌20例、胰腺癌8例、食管癌10例、結(jié)腸癌2例、膽囊癌3例、直腸癌3例、十二指腸癌3例、肺癌1例），男 35例、女 15例，年齡 21～85歲，平均63歲。均獲得活檢或者手術(shù)病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)。⑧ 肝良性病變60例（肝血管瘤40例、肝囊腫10例、肝膿腫3例、脂肪肝3例、酒精性肝病4例），男25例、女35例，年齡24～87歲，平均62歲。均經(jīng)B型超聲、CT、DSA和穿刺活檢中的一種或多種手段證實(shí)。⑨收集在我院進(jìn)行體檢的健康志愿者60例，男30例、女30例，年齡20～68歲，平均35歲。肝功能指標(biāo)檢測(cè)正常并B型超聲檢查排除實(shí)質(zhì)性占位。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集方法 抽取待檢者清晨空腹靜脈血 3 ml，室溫下自然凝集 30 min，36 000×g離心15 min，分離血清，將獲得的血清-80℃冰箱中保存，血清標(biāo)本的采集均獲得受檢者的知情同意。

1.2.2 檢測(cè)方法

1.2.2.1 ELISA法檢測(cè)血清GP73表達(dá)：取每例待檢者血清10 μl加人96孔板中，嚴(yán)格按照試劑盒（德國(guó)IBL進(jìn)口分裝）說明書的要求操作，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，每個(gè)待測(cè)血清重復(fù)2個(gè)孔。同時(shí)試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品以 5 個(gè)濃度（0、5、10、20、40﹑80 ng/ml）為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，以標(biāo)準(zhǔn)品5個(gè)濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)各點(diǎn)的A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式及相關(guān)系數(shù)，后根據(jù)公式通過A值計(jì)算每例待檢者血清樣品的GP73表達(dá)水平。

1.2.2.2 血清AFP測(cè)定：采用電化學(xué)發(fā)光按照全自動(dòng)Cobas601分析儀（瑞士Roche公司）的操作步驟檢測(cè)每例待檢者血清AFP水平，血清AFP水平的臨界參考值為20 ng/ml，待檢者血清AFP水平超出臨界值時(shí)，即判定為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由于各組樣本方差不齊，GP73和AFP水平以中位數(shù)表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS16.0軟件描繪受試者工作特征（ROC）曲線，分析GP73和AFP檢測(cè)效能并確定其臨界值，根據(jù)臨界值計(jì)算GP73和AFP診斷的陽(yáng)性率，以HCC患者出現(xiàn)AFP＞20 ng/ml或GP73＞43.40 ng/ml為真陽(yáng)性，膽管細(xì)胞癌患者出現(xiàn)GP73＞45.40 ng/ml為真陽(yáng)性，良性肝病患者陽(yáng)性為假陽(yáng)性；以HCC患者AFP≤20 ng/ml或GP73≤43.40 ng/ml為假陰性，膽管細(xì)胞癌患者GP73≤45.40 ng/ml為假陰性，良性肝病陰性為真陰性，判斷GP73、AFP單獨(dú)診斷HCC、膽管細(xì)胞癌的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確率；各組中血清GP73和AFP值間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組待檢血清GP73和AFP的表達(dá)水平

用于檢測(cè)血清GP73濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系良好。各實(shí)驗(yàn)組的GP73及AFP表達(dá)水平見表1，表2及圖1。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，HCC組、膽管細(xì)胞癌組及BCS合并HCC組患者血清GP73的表達(dá)水平顯著高于其他組 （P＜0.05）；HCC組、BCS合并HCC組患者血清AFP的表達(dá)水平顯著高于其他組（P＜0.05），膽管細(xì)胞癌組AFP的表達(dá)水平與健康體檢組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組血清GP73和AFP的表達(dá)水平

表2 各組血清GP73和AFP的表達(dá)水平

圖1 各組GP73及AFP表達(dá)水平

2.2 血清GP73和AFP表達(dá)水平在HCC及膽管細(xì)胞癌中的診斷價(jià)值

分別繪制GP73和AFP的ROC曲線，當(dāng)GP73取臨界值為43.40 ng/ml時(shí)，診斷HCC的靈敏度、特異度及正確率達(dá)到最佳，分別為90.8%、75.5%及77.6%，ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）為0.868；AFP取臨界值為20 ng/ml時(shí)，診斷HCC的靈敏度、特異度及正確率分別為60%、83.2%及80.2%，AUC為0.739。GP73診斷HCC的靈敏度及AUC明顯高于AFP，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），特異度及診斷正確率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。當(dāng)GP73取臨界值為45.40 ng/ml時(shí)，診斷HCC的靈敏度、特異度及正確率達(dá)到最佳，分別為88.6%、72.7%及73.9%，AUC為0.774。結(jié)果見表3、圖 2、圖 3。

表3 血清GP73和AFP的表達(dá)水平對(duì)診斷HCC、膽管細(xì)胞癌的靈敏度和特異度及正確率 ［%（n/n）］

圖2 血清GP73及AFP診斷HCC的ROC曲線

2.3 各組待檢者血清GP73和AFP表達(dá)水平之間的關(guān)系

圖3 血清GP73診斷膽管細(xì)胞癌的ROC曲線

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，各組待檢血清GP73和AFP表達(dá)水平之間均無相關(guān)性，HCC組r=0.018，P=0.887；膽管細(xì)胞癌組 r=-0.091，P=0.605；BCS合并HCC組r=0.061，P=0.708；乙型肝炎肝硬化組 r=-0.110，P=0.402；乙型肝炎組 r=-0.110，P=0.401；其他惡性腫瘤組 r=-0.117，P=0.373；BCS合并肝硬化組r=-0.047，P=0.747；肝良性腫瘤組r=-0.037，P=0.776； 健康志愿者組 r=-0.101，P=0.443。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法檢測(cè)490例待檢者的血清GP73水平，其血清中均能檢測(cè)到GP73的表達(dá)，且HCC、膽管細(xì)胞癌、BCS合并HCC組中GP73表達(dá)水平明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，與乙肝組相比，乙肝肝硬化組GP73表達(dá)水平較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），但AFP水平差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；BCS并肝硬化組與BCS并HCC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），與乙肝肝硬化組相比，GP73及AFP水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，血清GP73與AFP的表達(dá)水平之間沒有相關(guān)性 （P＞0.05）。與AFP相比，GP73診斷肝細(xì)胞肝癌的AUC及靈敏度顯著高于AFP（P＜0.05），GP73診斷膽管細(xì)胞癌的受試者工作特征曲線下面積為0.774，靈敏度、特異度及正確率分別為88.6%、72.7%及73.9%，而膽管細(xì)胞癌組中，AFP表達(dá)水平與健康志愿者相比無明顯升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），故沒有診斷價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化組GP73水平高于乙型肝炎組，HCC組GP73水平顯著高于肝硬化組和乙型肝炎組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；顯示GP73表達(dá)水平在由乙肝向乙肝肝硬化、HCC演化過程中逐漸升高，而AFP無此趨勢(shì)變化，提示對(duì)于有乙肝、乙肝肝硬化的患者，若其血清GP73＞43.35 ng/ml，可給予其定期上腹部超聲及CT檢查，或?qū)⒂兄贖CC的早期診斷與治療。

BCS合并HCC組的GP73表達(dá)水平明顯高于BCS合并肝硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示GP73表達(dá)水平與BCS的發(fā)生、發(fā)展所導(dǎo)致的淤血性肝硬化，乃至HCC過程中造成的的肝細(xì)胞損害嚴(yán)重程度較重有關(guān)，符合Iftikhar等［9］提出兩個(gè)關(guān)于GP73表達(dá)上調(diào)的機(jī)制：①是在由急性肝細(xì)胞損傷引發(fā)；②是慢性肝臟疾病的進(jìn)展。提示對(duì)于BCS的患者，若其血清 GP73較高（＞43.35 ng/ml），同樣可給予其定期上腹部超聲及CT檢查，或?qū)⒂兄贐CS合并HCC的早期診斷與治療。

［1］ 徐海峰，楊華瑜，張宏冰，等.改變肝癌早期診斷和治療現(xiàn)狀的新肝癌血清標(biāo)志物 ［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28：104-108.

［2］ Hu JS， Wu DW， Liang S， et al.GP73， a resident Golgi glycoprotein，is sensibility and specificity for hepatocellular carcinomaofdiagnosisin ahepatitisB-endemicAsian population［J］.Med Oncol， 2010， 27： 339-345.

［3］ Marrero JA，Romano PR，Nikolaeva O，et al.GP73，a resident Golgi glycoprotein，is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology， 2005， 43： 1007-1012.

［4］ 韓新強(qiáng)，祖茂衡，顧玉明，等.布-加綜合征合并肝癌36例臨床分析［J］.介入放射學(xué)雜志，2011，20： 207-209.

［5］ 魏 寧，祖茂衡，徐 浩，等.下腔靜脈膜型布加綜合征合并原發(fā)性肝癌的影像學(xué)診斷和臨床分析 （附14例病例）［C］.第六屆國(guó)際布加綜合征學(xué)術(shù)大會(huì)暨汪忠鎬血管論壇，2010：710-711.

［6］ 程永德，程英升，顏志平，等.常見惡性腫瘤介入治療指南［M］.北京：科學(xué)出版社，2013：69-73.

［7］ 中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部.原發(fā)性肝癌診療規(guī)范 （2011版）［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16：929-946.

［8］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南 （2010年版）［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2010，21：121-122.

［9］ Iftikhar R，Kladney RD，Havlioglu N，et al.Disease-and cellspecific expression of GP73 in human liver disease ［J］.Am J Gastroenterol， 2004， 99： 1087-1095.