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    甲胎蛋白陰性肝癌射頻消融治療前血清中轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNA的臨床價值

    2014-11-01 06:23:56占美曉胡寶山黃建文陸驪工
    介入放射學(xué)雜志 2014年7期
    關(guān)鍵詞:生存率復(fù)發(fā)率陰性

    占美曉, 李 勇, 胡寶山, 何 旭, 黃建文, 陸驪工

    近年來,以射頻消融術(shù)(RFA)為主的微創(chuàng)治療在早期肝癌治療中的療效越來越得到認可。然而研究發(fā)現(xiàn)RFA術(shù)后的5年復(fù)發(fā)率卻可高達70%,術(shù)后高復(fù)發(fā)率已成為影響患者RFA術(shù)后遠期療效的重要因素[1-2]。 對于血清甲胎蛋白(AFP)升高的肝癌患者,AFP常作為腫瘤標記物以預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)或預(yù)后。臨床上仍然有30%~40%患者AFP陰性(≤20 ng/ml),對此類患者,目前尚無理想的腫瘤標記物[3]。 microRNA(miRNA)是一類進化上高度保守的非編碼單鏈RNA,可影響細胞發(fā)育、分化、干細胞功能等多種病理生理過程,在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中亦發(fā)揮重要作用。近年,諸多研究已經(jīng)證實腫瘤組織中高表達的miRNAs可以釋放到循環(huán)血液中,且表達穩(wěn)定,循環(huán)miRNAs(血清或血漿等)被廣泛用于理想的腫瘤標記物[4-5]。本研究選擇的轉(zhuǎn)移相關(guān)miR-18b在肝癌組織中高表達且與腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)后密切相關(guān)[6],本研究重點探索miR-18b是否可以作為腫瘤標記物去監(jiān)測AFP陰性肝癌患者RFA術(shù)后復(fù)發(fā)。

    1 材料與方法

    1.1 臨床資料

    2007年1月—2011年1月,我科診治的接受RFA治療的AFP陰性肝癌患者131例,收集患者RFA治療前1~2 d的血清標本。肝癌診斷標準根據(jù)衛(wèi)生部制定的原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2011年版),所有患者均行肝穿刺活檢病理確診為肝細胞癌。RFA治療儀器采用RITA射頻治療系統(tǒng)(美國)。納入的患者中男98例,女33例,平均年齡57.6歲;87例患者單病灶,44例患者多病灶 (2個或3個);腫瘤平均直徑3.2 cm。我們選取43例健康體檢者的血清標本作為對照組,包括男31例,女12例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準且所有納入的研究者均獲得知情同意。

    1.2 方法

    1.2.1 標本的采集 本組患者在RFA術(shù)前1~2 d采集靜脈血標本約8 ml,室溫下靜置30 min,靜置后于4℃1 500 r/min離心10 min。將上層血清吸出移至新的1.5 ml EP管,放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 血清miR-18b的檢測 所有血清樣本放置于冰上,每個樣本取300 μl轉(zhuǎn)移至含有750 μl TRI Reagent BD的新EP管中,依據(jù)TRIzol試劑(Invitrogen公司,美國)說明書抽提總 RNA,所有RNA通過分光光度計檢測并定量,提取好的RNA保存于-80℃冰箱內(nèi)。采用實時定量PCR技術(shù)檢測miR-18b 表達量[7], 反轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為 18 μl,PCR總反應(yīng)體系為 19 μl。選擇 U6作為內(nèi)參基因,miR-18b的相對表達量用 2-ΔΔCT表示, 其中ΔCT肝癌患者/健康正常人= CTmiRNAs- CTU6;ΔΔCT =ΔCT肝癌患者- ΔCT健康正常人。

    1.2.3 隨訪 隨訪截止時間為2012年5月。所有患者術(shù)后1個月行腹部增強CT觀察消融效果,RFA術(shù)后未能達到腫瘤完全消融的患者被排除于本研究。其后每3個月行腹部增強CT檢查及血清檢測AFP及肝功能指標以判斷有無出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。RFA術(shù)后復(fù)發(fā)形式主要有腫瘤局部進展、肝內(nèi)遠處復(fù)發(fā)及肝外轉(zhuǎn)移。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩組血清miR-18b的表達差異及其同臨床病理資料間的關(guān)系用t檢驗或秩和檢驗。Kaplan-Meier生存分析和log-rank檢驗分析miR-18b表達量同患者總生存率及無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系。數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 miR-18b在肝癌患者中表達差異及相關(guān)的臨床病理因素

    miR-18b在AFP陰性肝癌患者血清中表達水平顯著高于健康正常人(2.93±1.33對1.08±0.45,P<0.01,圖1)。超過85%患者miR-18b表達上調(diào)的倍數(shù)在2倍以上。所有131例患者中,血清miR-18b表達水平上調(diào)的中位倍數(shù)為2.7倍。以3倍為分界點,我們將131例肝癌患者分為高表達組(66例)和低表達組(65例)。研究結(jié)果顯示:miR-18b表達水平差異與肝硬化、腫瘤直徑及腫瘤分化程度密切相關(guān),而與性別、乙肝表面抗原、腫瘤數(shù)目等無明顯相關(guān)性(表1)。

    2.2 血清miR-18b與肝癌患者RFA術(shù)后復(fù)發(fā)之間的關(guān)系

    截止至末次隨訪日,共有79例患者(60.3%)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。肝內(nèi)復(fù)發(fā)70例,包括13例肝內(nèi)腫瘤局部進展和57例肝內(nèi)遠處復(fù)發(fā)。16例出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移,其中7例合并肝內(nèi)遠處和肝外轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示出現(xiàn)復(fù)發(fā)患者血清miR-18b的表達水平顯著高于無復(fù)發(fā)患者(3.26± 1.28比 2.42±0.86,P <0.01,圖 1)。根據(jù)復(fù)發(fā)的不同形式,進一步分析兩組血清miR-18b表達水平與復(fù)發(fā)率之間的關(guān)系顯示:miR-18b高表達組患者RFA術(shù)后肝內(nèi)遠處復(fù)發(fā)率 (P=0.018)和肝外轉(zhuǎn)移發(fā)生率(P=0.102)均高于低表達組(表2),而兩組在腫瘤局部進展發(fā)生率上無差異 (P=0.792)。

    圖1 肝癌患者及健康正常人血清中miR-18b的表達水平

    2.3 血清miR-18b與總生存率及無復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系

    表1 血清miR-18b表達高低同肝癌患者臨床病理因素間的關(guān)系

    表2 血清miR-18b同RFA術(shù)后不同復(fù)發(fā)形式發(fā)生率之間的關(guān)系 n(%)

    肝癌患者 1、3、5年總生存率分別為 86.3%、63.4% 、43.5% ;1、3、5 年 無 復(fù) 發(fā) 生 存 率 分 別 為64.9%、41.7%、29.0%。Kaplan-Meier生存分析顯示miR-18b高表達組患者總生存率和無復(fù)發(fā)生存率均顯著低于低表達組患者,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖 2)。

    3 討論

    圖2 miR-18b高低表達與RFA術(shù)后有無復(fù)發(fā)的比較

    Kao 等[8]報道對于 AFP 升高的患者,RFA 術(shù)前術(shù)后AFP的變化可以預(yù)測肝癌患者的復(fù)發(fā)及總生存率。對于AFP陰性肝癌患者,有報道顯示血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)等腫瘤標記物可以用來預(yù)測外科切除或肝動脈化療栓塞(TACE)術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[9-10]。 本研究重點探索可以用于預(yù)測AFP陰性患者RFA術(shù)后腫瘤進展、預(yù)后的標記物,對判斷RFA術(shù)后患者的遠期療效意義重大。

    血清miRNAs為腫瘤標記物的探索提供了新的視角。相比腫瘤組織取材,血清取樣具有創(chuàng)傷小、操作簡便、可重復(fù)性等優(yōu)點。本研究結(jié)果顯示肝癌患者血清中miR-18b的普遍高表達,且與肝硬化、腫瘤直徑及腫瘤分化程度相關(guān)。此研究結(jié)果與前期Murakami等[6]在腫瘤組織中觀察到 miR-18b的表達規(guī)律相一致。諸多證據(jù)已證實腫瘤組織或細胞內(nèi)特異的miRNAs在細胞破壞或病理損害的過程中會釋放到循環(huán)血液中,而在血清或血漿中穩(wěn)定表達[11-12]。肝癌RFA治療后腫瘤組織缺血、壞死,部分腫瘤細胞凋亡或停止增殖,因此我們有理由推測血清中高表達的miR-18b可能來自腫瘤組織熱消融過程中組織壞死釋放入血液中,血清miR-18b表達水平差異或可一定程度上反映腫瘤的消融壞死情況。

    血清miRNAs除了可以用于腫瘤疾病的診斷外,如前列腺癌[13]、胃癌[5]等,還可以用于腫瘤患者不同方法治療后的療效評估。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)血漿miR-221可以預(yù)測乳腺癌患者新輔助化療的耐藥性的出現(xiàn);Jung等[15]研究提示乳腺癌患者血漿miR-210表達水平顯著升高,且和曲妥珠單抗藥物敏感性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。Murakami等[6]研究提示miR-18b通過調(diào)控靶基因TNRC6B的表達,在肝癌細胞轉(zhuǎn)移、血管侵犯、腫瘤進展等方面扮演重要角色,組織中高表達miR-18b或低表達TNRC6B的患者預(yù)后差,無復(fù)發(fā)生存率顯著降低。本研究通過結(jié)合特殊臨床特征的(AFP陰性)肝癌患者RFA術(shù)前血清miR-18b的表達水平和RFA術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)后的情況進行分析,發(fā)現(xiàn)血清中高表達的miR-18b與RFA術(shù)后高復(fù)發(fā)率之間密切相關(guān),且可以作為腫瘤標記物去預(yù)測肝癌患者RFA術(shù)后無復(fù)發(fā)生存率。除無復(fù)發(fā)生存率外,本研究結(jié)果也提示血清中miR-18b高表達的患者預(yù)后差,總生存率顯著低于表達組患者。

    綜上所述,本研究結(jié)果提示血清miR-18b具有成為肝癌理想腫瘤標記物的優(yōu)勢,可用以監(jiān)測AFP陰性肝癌患者RFA術(shù)后復(fù)發(fā)和預(yù)測患者總生存率。miRNAs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜,常既充當(dāng)“癌基因”又可充當(dāng)“抑癌基因”的角色,因此在本研究的基礎(chǔ)上,以下問題后續(xù)仍需繼續(xù)探索:肝癌患者血清中其他轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs(miR-151、miR-222、miR-30 d)的臨床價值的探索;能否聯(lián)合其他類型腫瘤標記物 (VEGF、缺氧誘導(dǎo)因子-1a等)去判斷腫瘤進展及預(yù)后;擴大樣本量,進一步驗證血清miR-18b的價值以便真正轉(zhuǎn)化臨床,使患者受益。

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