吉西他濱對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及表沒食子兒茶素沒食子酸酯的保護(hù)作用

劉旭杰，秦?zé)?，陳淑?/p>

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吉西他濱對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及表沒食子兒茶素沒食子酸酯的保護(hù)作用

劉旭杰，秦?zé)?，陳淑?/p>

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室

觀察吉西他濱對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及表沒食子兒茶素沒食子酸酯的保護(hù)作用。

利用植塊法分離大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。SRB 法檢測(cè)藥物對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞和 A549 增殖的影響。流式細(xì)胞儀用于檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白含量。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧和超氧化物歧化酶水平以及乳酸脫氫酶滲透情況。

吉西他濱能顯著減少肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖并將其阻滯于 S 期。吉西他濱引起肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡具有時(shí)間依賴性，處理 24、48、72 h 后細(xì)胞凋亡率分別為 7.2%、15.4%、23.3%。同時(shí)，吉西他濱作用后細(xì)胞內(nèi)活性氧含量上升，而處理 48 h 后超氧化物歧化酶水平顯著下降。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，表沒食子兒茶素沒食子酸酯能夠提高吉西他濱處理后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，并且減弱吉西他濱造成的超氧化物歧化酶水平的下降。

吉西他濱對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有損傷作用，能夠引起肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激的發(fā)生，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)吉西他濱引起的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化性應(yīng)激； 兒茶酚類； 吉西他濱

吉西他濱（gemcitabine）是一種脫氧胞苷類似物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌等實(shí)體瘤的治療[1]。但隨著臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，其引發(fā)嚴(yán)重肺毒性的報(bào)道也逐漸增多。臨床研究顯示，超過 23% 的患者由于使用吉西他濱，出現(xiàn)嚴(yán)重呼吸困難、彌散性肺泡損傷、間質(zhì)性肺炎等肺部癥狀[2]。嚴(yán)重肺損傷限制了化療的延續(xù)性和患者的生活質(zhì)量。因此，研究吉西他濱導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制并加以改善是提高其臨床效果的一個(gè)重要方向。

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs）是肺泡毛細(xì)血管單位的基本組成部分，在維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)及引發(fā)炎癥等方面發(fā)揮重要作用。PMVECs 易于受到吸入性或肺循環(huán)中毒劑的影響，引發(fā)動(dòng)物和人的急性肺損傷[3]。研究顯示，氧化應(yīng)激是藥物誘發(fā)肺毒性的損傷機(jī)制之一，其能夠引發(fā)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、血管結(jié)構(gòu)和功能的異常[4]。體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的上升或氧化防御機(jī)制的失調(diào)，均能引發(fā)氧化應(yīng)激。已有報(bào)道，多種胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性與細(xì)胞內(nèi) ROS 水平正相關(guān)[5]。

本論文通過分離大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別從細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激兩方面研究吉西他濱對(duì) PMVECs 的影響。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是從綠茶中提取的多酚類物質(zhì)，屬于兒茶素家族，具有抗增殖、抗突變、抗氧化、防癌等多種作用[6]。本文同時(shí)探索 EGCG 對(duì)吉西他濱引起 PMVECs 損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性Sprague-Dawley 大鼠（SPF 級(jí)），購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心，體重 100~120 g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0004。

1.1.2 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞肺癌 A549 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑和試劑盒 吉西他濱購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100622-201202；EGCG 購自江西綠康天然產(chǎn)物有限責(zé)任公司，純度為 98%，批號(hào)：D98-120602；ROS 熒光探針CM-H2DCFDA 購自美國 Invitrogen 公司；磺基羅丹明B（SRB）、PI 均購自美國 Sigma Aldrich 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640 培養(yǎng)基均購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；小鼠抗大鼠 CD31 抗體購自美國 Abcam 公司；兔抗 caspase-3 抗體、兔抗 PARP 抗體均購自美國 CST 公司；小鼠抗 β-actin 抗體購自天津三箭生物技術(shù)有限公司；羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠/兔 IgG 抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；化學(xué)發(fā)光 HRP 底物試劑盒購自美國 Millipore 公司；RIPA 細(xì)胞裂解液購自北京 GenStar 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購自北京寶賽生物公司；乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.4 儀器 TE2000-U 型熒光顯微鏡為日本 Nikon 公司產(chǎn)品；Multiskan MK 3 酶標(biāo)儀為美國 Thermo 公司產(chǎn)品；Coulter epics XL 流式細(xì)胞儀為美國 Beckman 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠 PMVECs 的分離、培養(yǎng)和鑒定 選用體重 100~120 g 的健康雄性 SD 大鼠，參考文獻(xiàn)[7-8]，按植塊培養(yǎng)方法進(jìn)行大鼠 PMVECs 的原代培養(yǎng)。同時(shí)應(yīng)用抗 CD31 抗體進(jìn)行免疫熒光法鑒定，取其中 3 ~ 5 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌 A549 培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.3 SRB 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，每孔 100 μl 接種于 96 孔培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱，經(jīng) 24 h 貼壁后，每孔加入 100 μl 不同濃度的藥液；繼續(xù)培養(yǎng) 48~72 h 后，棄去培養(yǎng)基并加入 100 μl 10% 三氯乙酸溶液，于 4 ℃固定 1 h，用蒸餾水沖洗 5 次后晾干；然后加入 0.4% SRB，染色 5 min，用 1% 乙酸溶液沖洗 5 次后晾干；加入 100 μl Tris 溶液（10 mmol/L）溶解結(jié)合的 SRB；使用酶標(biāo)儀于 560 nm 波長(zhǎng)讀取各孔光吸收值。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)于 25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（5 × 105個(gè)/瓶）；培養(yǎng) 24 h 后加入不同濃度的藥物進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行樣品處理，然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例。

1.2.5 細(xì)胞周期分析 細(xì)胞以 5 × 105個(gè)/瓶接種于 25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶；經(jīng) 24 h 培養(yǎng)貼壁后，加入 1 μmol/L 吉西他濱分別處理 24、48、72 h；利用胰酶消化收集細(xì)胞，并用 70% 乙醇溶液于–20 ℃固定過夜；使用 50 μg/ml PI 染色 30 min 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.6 Western blot 檢測(cè) 將待檢測(cè)細(xì)胞置于冰上，并用 RIPA 細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞 30 min，收集細(xì)胞裂解液；于 4 ℃使用 12 000 ×離心細(xì)胞裂解液 15 min，并收集上清；然后利用 12% 凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳，并轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上；使用 5% 脫脂牛奶溶液封閉膜上非特異抗原位點(diǎn)，再加入相應(yīng)一抗（1:1000 稀釋）4 ℃孵育過夜，并用 TBST 洗 5 次；然后加入對(duì)應(yīng)二抗（1:4000 稀釋），再用 TBST 洗 5 次；使用 HRP 底物試劑盒進(jìn)行顯影。

1.2.7 ROS 含量檢測(cè) 以 5 × 103個(gè)/孔將 PMVECs 種于 96 孔黑壁透明底培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h 使其貼壁；給予 0.1、1、10 μmol/L 吉西他濱處理 12 h；藥物處理后，使用 PBS 洗 1 次，并加入 10 μmol/L CM-H2DCFDA作用 30 min；使用熒光酶標(biāo)儀讀取各孔熒光強(qiáng)度。使用以下公式計(jì)算各孔熒光強(qiáng)度增值百分比：

熒光增值百分比=[（F1– F0）/F0]× 100%，其中，F(xiàn)1為給藥組熒光強(qiáng)度；F0為對(duì)照組熒光強(qiáng)度。

1.2.8 乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè) 根據(jù)乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒操作步驟，檢測(cè) 0.1、1、10 μmol/L 吉西他濱處理后，PMVECs 細(xì)胞培養(yǎng)液上清中 LDH 含量的變化。

1.2.9 細(xì)胞內(nèi) SOD 活性檢測(cè) 以0.1、1、10 μmol/L 藥物濃度處理細(xì)胞48、72 h，按照總 SOD 活性檢測(cè)試劑盒操作步驟，利用 WST 法進(jìn)行樣品處理，并用酶標(biāo)儀在 450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 PMVECs 形態(tài)學(xué)及免疫熒光鑒定結(jié)果

通過顯微鏡觀察，植塊貼壁后，血細(xì)胞首先從組織塊邊緣游出；培養(yǎng) 24 h 后，PMVECs開始由植塊周圍爬出，貼壁生長(zhǎng)；繼續(xù)培養(yǎng)至 60 ~ 72 h 間，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使組織塊脫落并吸棄，避免成纖維細(xì)胞爬出。培養(yǎng)至 9 d，細(xì)胞基本匯合成片后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。由于血細(xì)胞不貼壁，隨傳代操作被棄去。PMVECs 在顯微鏡下呈現(xiàn)上皮樣細(xì)胞形態(tài)，匯集成片后，呈鋪路石樣排列生長(zhǎng)（圖 1A、B）。與 PBS 替代一抗的陰性對(duì)照組相比，PMVECs 的免疫熒光檢測(cè)呈現(xiàn) CD31 抗原陽性表達(dá)（圖 1C、D）。

2.2 吉西他濱對(duì) PMVECs 和 A549 的增殖抑制活性

為了評(píng)估吉西他濱的血管損傷作用，使用不同濃度（0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10 μmol/L）吉西他濱分別處理 PMVECs 和 A549 細(xì)胞 48 和 72 h。然后利用 SRB 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，吉西他濱對(duì)兩種細(xì)胞的抑制增殖作用具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性（圖 2），而且對(duì)于兩種細(xì)胞來說，吉西他濱的抑制作用均在 0.03 ~ 1 μmol/L 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)顯著變化。因此，吉西他濱在抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的濃度范圍內(nèi)對(duì) PMVECs 亦有損傷作用。

2.3 吉西他濱對(duì) PMVECs 產(chǎn)生 S 期阻滯作用

為了進(jìn)一步說明吉西他濱抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們檢測(cè)了 1 μmol/L 吉西他濱處理 24、48 和 72 h 后，PMVECs 細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示，吉西他濱處理后 S 期細(xì)胞所占比例增加，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，藥物處理 24、48 和 72 h 相對(duì)應(yīng)的S 期細(xì)胞比例為 15.0%、27.4%、35.5%、47.2%；G2/M 期細(xì)胞顯著減少（圖 3）。同時(shí)，Sub-G1峰比例逐漸增加，說明吉西他濱引起細(xì)胞周期阻滯，繼而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生。

2.4 吉西他濱誘導(dǎo) PMVECs 凋亡

細(xì)胞凋亡也是藥物引起損傷的一個(gè)表現(xiàn)，本研究利用 Annexin V/PI 染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。1 μmol/L 吉西他濱處理細(xì)胞后，PMVECs 的凋亡率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加；與對(duì)照組 6.2% 的凋亡率比較，藥物作用 24、48 和 72 h 相對(duì)應(yīng)的凋亡率分別為 7.2%、15.4%、23.3%（圖 4A）。吉西他濱引起的細(xì)胞凋亡也具有濃度依賴性，藥物濃度為 0.1、1、10 μmol/L 時(shí)細(xì)胞凋亡率為 6.9%、13.7%、11.6%，而對(duì)照組為 6.9%。為了進(jìn)一步說明吉西他濱處理與 PMVECs 細(xì)胞凋亡的關(guān)系，利用Western blot對(duì)細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)及活化情況進(jìn)行了檢測(cè)。根據(jù)圖 4C 顯示，吉西他濱作用 48 h 后能夠激活 PMVECs 細(xì)胞內(nèi) caspase-3，同時(shí)也上調(diào) PARP 剪切體的含量。由此可以判斷，吉西他濱能夠誘導(dǎo) PMVECs 細(xì)胞凋亡。

圖 1 PMVECs 的原代培養(yǎng)（A：組織塊貼壁后 60 h 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)；B：90 h 后細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)）和使用抗 CD31 抗體進(jìn)行 PMVECs 免疫熒光鑒定（紅色表示 CD31 位點(diǎn)；藍(lán)色表示細(xì)胞核；C：鑒定組，一抗和二抗；D：對(duì)照組，PBS 和二抗）（× 100）

Figure 1 Primary culture of PMVECs (A: The proliferation of PMVECs in 60 h after explants adhered to flasks; B: The proliferation of PMVECs in 90 h) and PMVECs identified with CD31 antibody by immunofluorescence staining (Red color represents CD31; Blue color indicates nuclei; C: Identification, primary antibody and secondary antibody; D: Control, PBS and secondary antibody) (× 100)

圖 2 吉西他濱對(duì)于 PMVECs（A）和 A549（B）的抑制增殖作用（n = 4）

Figure 2 Anti-proliferation effects of gemcitabine in PMVECs (A) and A549 (B) cells (n = 4)

對(duì)照組 Control24 h G1/G0：59.4%S：15.0%G2/M：25.6%Sub-G1：5.8%G1/G0：68.1%S：27.4%G2/M：4.5%Sub-G1：6.9% 48 h72 h G1/G0：59.4%S：35.5%G2/M：5.1%Sub-G1：26.9%G1/G0：52.2%S：47.2%G2/M：0.6%Sub-G1：41.6%

Figure 3 Effects of gemcitabine on the regulation of cell cycle distribution in PMVECs

圖 4 吉西他濱引起 PMVECs 細(xì)胞凋亡（A：不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；B：不同藥物濃度對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；C：凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況）

Figure 4 Gemcitabine caused apoptosis of PMVECs (A: Cell apoptosis at the different times; B: Cell apoptosis at the different concentrations of gemcitabine; C: The expression of apoptosis-related proteins)

圖 5 吉西他濱處理后 PMVECs 產(chǎn)生氧化應(yīng)激（A：ROS 含量；B：SOD 活性）（**P < 0.01，n = 3）

Figure 5 Gemcitabine induced oxidative stress in PMVECs (A: ROS; B: SOD) (**< 0.01, n = 3)

2.5 吉西他濱處理后 PMVECs 產(chǎn)生氧化應(yīng)激

2.5.1 細(xì)胞內(nèi) ROS 含量的檢測(cè) 通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS 含量，判斷 PMVECs 經(jīng)過吉西他濱處理后是否出現(xiàn)氧化應(yīng)激。由于 CM-H2DCFDA 能夠進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞內(nèi) ROS 反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，所以可以通過產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度對(duì)細(xì)胞內(nèi) ROS 進(jìn)行定量分析。PMVECs 在不同濃度吉西他濱處理 12 h 后，10 μmol/L 藥物組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度出現(xiàn)明顯提升（**< 0.01），相對(duì)對(duì)照組增值為（16.0 ± 7.3）%（圖 5A）。

2.5.2 細(xì)胞內(nèi) SOD 水平的檢測(cè) 除了檢查 ROS 水平，我們進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)氧化防御機(jī)制中關(guān)鍵酶 SOD 的活性。經(jīng)過吉西他濱處理后，細(xì)胞內(nèi) SOD 水平顯著下降（**< 0.01）。吉西他濱處理 24、48、72 h 后，細(xì)胞內(nèi) SOD 活力分別相當(dāng)于對(duì)照組的（86.2 ± 0.9）%、（65.9 ± 2.0）%、（40.2 ± 2.9）%（圖 5B）。

2.5.3 LDH 細(xì)胞毒性檢測(cè) 為了檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激后是否出現(xiàn)膜損傷，進(jìn)行了 LDH 細(xì)胞毒性檢測(cè)，通過細(xì)胞培養(yǎng)基上清中 LDH 含量反映細(xì)胞膜受損情況。圖 6 顯示細(xì)胞培養(yǎng)基上清中 LDH 含量隨吉西他濱濃度增加而顯著上升，同時(shí)隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，LDH 含量也有所提高。相對(duì)對(duì)照組，10 μmol/L 吉西他濱作用 48 和 72 h 對(duì)應(yīng)的 LDH 相對(duì)增值為（21.1 ± 7.8）%、（28.8 ± 6.5）%，具有顯著性差異（**< 0.01）。

LDH 細(xì)胞毒性（%）LDH cytotoxicity (%)4035302520151050 0.1 1 10 吉西他濱濃度（μmol/L）Concentration of gemcitabine (μmol/L)

Figure 6 LDH cytotoxicity assay of PMVECs with gemcitabine (**< 0.01, n = 3)

2.6 EGCG 對(duì)吉西他濱損傷 PMVECs 的保護(hù)作用

2.6.1 EGCG 增加 PMVECs 存活率 通過 SRB 法檢測(cè)多種血管保護(hù)藥對(duì)吉西他濱損傷PMVECs 的作用，我們發(fā)現(xiàn) EGCG 具有保護(hù)作用。如圖 7 顯示，EGCG 單藥或與吉西他濱聯(lián)用時(shí)均能顯著提高 PMVECs 的存活（*< 0.05），并具有濃度依賴性。其中 0.1和1 μmol/L 吉西他濱單藥處理后， PMVECs 存活率分別為（96.4 ± 2.4）%、（54.3 ±2.7）%，而 25 μmol/L EGCG 與 0.1、1 μmol/L 吉西他濱聯(lián)用時(shí)，存活率分別為（127.9 ± 20.9）% 和（64.4 ± 4.1）%；而 EGCG 對(duì)于吉西他濱抑制肺癌 A549 細(xì)胞的作用并無明顯影響（圖 7）。

2.6.2 EGCG 提高 PMVECs 細(xì)胞內(nèi) SOD 水平 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總 SOD 活性的結(jié)果如圖 8 所示，25 μmol/L EGCG 單藥組與陰性對(duì)照組相比，PMVECs 內(nèi) SOD 活性增加了（30.2 ± 2.0）%，（**< 0.01）。同時(shí)，25 μmol/L EGCG 和 1 μmol/L吉西他濱聯(lián)用組與 1 μmol/L 吉西他濱單藥組比較，SOD 活性提高了（30.1 ± 9.0）%（**< 0.01）。因此，說明 EGCG 能夠提高 PMVECs 細(xì)胞內(nèi) SOD 水平，一定程度逆轉(zhuǎn)吉西他濱引起的 SOD 水平下降。

Figure 7 Effects of EGCG and gemcitabine on the survival of PMVECs (A) and A549 (B) cells (*< 0.05)

SOD 相對(duì)活性（%）Vitality of SOD (%)140120100806040200 對(duì)照組 EGCG GEM GEM + EGCG Control

Figure 8 Effects of EGCG and gemcitabine on the activity of SOD in PMVECs (EGCG: 25 μmol/L; GEM: 1 μmol/L;**< 0.01, n = 3)

3 討論

理想的抗癌藥物應(yīng)能夠在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)不影響正常組織細(xì)胞的功能。因此，研究目前抗癌藥物的副作用并加以改善是探索理想藥物的捷徑。在目前的臨床實(shí)踐中，吉西他濱是最常見的抗腫瘤藥物之一，被 FDA 批準(zhǔn)用于治療多種腫瘤。然而，Belknap 等[9]的研究顯示，1997 – 2003 年，關(guān)于吉西他濱引起肺毒性的報(bào)告有 178 篇。而針對(duì)吉西他濱引發(fā)的肺損傷，主要通過停止給予吉西他濱并使用甾體類藥物治療，如甲基強(qiáng)的松龍，但仍有一部分患者出現(xiàn)致死癥狀[10-12]。有研究表明，急性肺損傷與藥物引起的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)[3]。本文通過分離大鼠 PMVECs，研究吉西他濱對(duì)大鼠 PMVECs 的體外作用。與吉西他濱對(duì)肺癌 A549 細(xì)胞的作用相似，其對(duì) PMVECs 具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性的抑制增殖作用，并具有S 期阻滯作用。因此，吉西他濱發(fā)揮抗癌作用的同時(shí)也抑制了 PMVECs 的活性。

吉西他濱作為脫氧胞苷類似物，能夠摻入 DNA 合成并干擾 DNA 復(fù)制。有文獻(xiàn)報(bào)道，吉西他濱的細(xì)胞毒作用主要是摻入 DNA 并啟動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程，而不是僅終止 DNA 復(fù)制[13-14]。我們的結(jié)果顯示，吉西他濱引起的細(xì)胞凋亡率主要隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)而提高，但當(dāng)藥物濃度達(dá)到一定水平后凋亡率變化無明顯濃度依賴性。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3 和 PARP 的檢測(cè)也說明吉西他濱能夠引起 PMVECs 凋亡。而以上結(jié)果中，吉西他濱引起的細(xì)胞凋亡并不是十分明顯。因此，凋亡可能是吉西他濱損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)途徑，而不是主要的損傷途徑。吉西他濱引起的內(nèi)皮損傷可能是多種機(jī)制綜合的結(jié)果，我們同時(shí)檢測(cè)了氧化應(yīng)激在此過程中發(fā)揮的作用。

細(xì)胞內(nèi) ROS 水平的穩(wěn)定是影響細(xì)胞氧化還原平衡和細(xì)胞增殖的重要因素。雖然細(xì)胞具有精密的氧化調(diào)控機(jī)制，但是許多抗腫瘤藥物仍能引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激一方面參與對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，如吉西他濱能夠提升 A549 細(xì)胞的 ROS 水平[15]；另一方面引起對(duì)正常組織的損傷，如吉西他濱的結(jié)構(gòu)類似物阿糖胞苷能夠通過引發(fā)氧化應(yīng)激而促進(jìn)體外培養(yǎng)的大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[16]。同時(shí)，大量文獻(xiàn)顯示，ROS 的產(chǎn)生能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引發(fā)血管損傷[17-19]。我們通過檢測(cè)吉西他濱對(duì) PMVECs 細(xì)胞內(nèi) ROS 和 SOD 的影響發(fā)現(xiàn)，吉西他濱能夠降低細(xì)胞內(nèi)氧化防御機(jī)制關(guān)鍵酶 SOD 的活性，并提升 ROS 水平。LDH 細(xì)胞毒性顯示吉西他濱處理后的 PMVECs 出現(xiàn)細(xì)胞膜滲漏的現(xiàn)象。這些結(jié)果說明，吉西他濱能夠通過氧化途徑損傷 PMVECs。

EGCG 具有一定的心血管保護(hù)作用，包括調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能紊亂、心肌肥大、高血壓、心肌細(xì)胞損傷等作用[20]。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EGCG 在相對(duì)小劑量（25 μmol/L）時(shí)與吉西他濱聯(lián)用能夠減弱吉西他濱對(duì) PMVECs 的增殖抑制作用，而在相應(yīng)藥物劑量下并未影響吉西他濱對(duì)肺癌 A549 細(xì)胞的抑制作用，表現(xiàn)出對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的不同作用效果。同時(shí)，EGCG 也能增加 PMVECs 細(xì)胞內(nèi) SOD 的活性，此種作用可能是 EGCG 顯示出對(duì) PMVECs 具有保護(hù)作用的原因。然而，EGCG 對(duì) A549 細(xì)胞并未顯示出保護(hù)作用，推斷 ROS 在吉西他濱對(duì) A549 細(xì)胞的細(xì)胞毒性中作用微弱，而在 PMVECs 損傷中具有較大影響；具體原因尚需要進(jìn)一步探索?？傊?，EGCG 對(duì)吉西他濱作用于腫瘤細(xì)胞和正常血管內(nèi)皮的影響具有差異。

綜上所述，吉西他濱能夠引起肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而這種損傷作用一方面通過增加細(xì)胞凋亡產(chǎn)生，另一方面通過引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激介導(dǎo)。而 EGCG 能夠在不影響吉西他濱對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用下，減弱吉西他濱引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。吉西他濱與 EGCG 的聯(lián)用方式有待于進(jìn)一步研究，可為減緩吉西他濱所引起的肺毒性提供幫助。

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Damage of gemcitabine towards pulmonary microvascular endothelial cells and protective effects of EGCG

LIU Xu-jie, QIN Ye, CHEN Shu-zhen

To investigate the damage of gemcitabine on rat pulmonary microvascular endothelial cells and the protective effect of EGCG.

PMVECs were isolated by modification of a tissue explant method. SRB assay was used to investigate the growth of PMVECs and A549 cells. Flow cytometry was applied to measure the cell cycle and apoptosis. Western blot was used to determine the content of apoptosis-related proteins. The activities of ROS, SOD and LDH were examined with microplate reader.

The exposure to gemcitabine decreased the survival of PMVECs and arrested PMVECs at S phase. Gemcitabine increased the number of apoptotic cells time-dependently and the percentage of apoptotic cells treated for 24, 48, 72 h were 7.2%, 15.4%, 23.3%, respectively. Meanwhile, intracellular ROS level of PMVECs was elevated and after 48 h the SOD level was lowered markedly after gemcitabine treatment. Further investigation revealed that EGCG increased cell viability of PMVECs with or without gemcitabine and augmented the intracellular SOD level of PMVECs reduced by gemcitabine.

These results suggest that gemcitabine injures PMVECs by inducing pulmonary endothelial cell apoptosis and oxidative stress. EGCG exerts the protective effect on gemcitabine-induced endothelial cells injury.

Endothelial cells; Oxidative stress; Catechols; Gemcitabine

CHEN Shu-zhen, Email: bjcsz@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.005

國家自然科學(xué)基金（81072664、81373437）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301002-001-022-01）

陳淑珍，Email：bjcsz@imb.pumc.edu.cn

2014-03-18

Author Affiliation: Laboratory of Oncology, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China