烷基化低分子量聚乙烯亞胺作為基因遞送載體的初步研究

柳珊，黃偉，金明姬，權修權，高鐘鎬

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烷基化低分子量聚乙烯亞胺作為基因遞送載體的初步研究

柳珊，黃偉，金明姬，權修權，高鐘鎬

100050 北京，中國醫(yī)學科學院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室（柳珊、黃偉、金明姬、高鐘鎬）；133000 吉林延吉，延邊大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（權修權）

考察烷基化低分子量聚乙烯亞胺作為基因遞送載體的安全性和有效性。

以1-溴十二烷和分子量為 1800 的分枝狀 PEI（bPEI1.8K）為原料，合成 bPEI1.8K-C12，并用1H-NMR 對其結(jié)構(gòu)進行確認；采用 MTT 法考察 bPEI1.8K-C12的細胞毒性；紅細胞溶血實驗考察 bPEI1.8K-C12的生物相容性；測定 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的粒徑分布和 zeta 電位；采用激光共聚焦顯微鏡觀察 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的細胞攝取行為；采用瓊脂糖凝膠阻滯電泳考察 bPEI1.8K-C12對 DNA 的固縮能力；并用熒光素酶報告基因和綠色熒光蛋白報告基因考察 bPEI1.8K-C12的體外轉(zhuǎn)染效率。

經(jīng)1H-NMR 確認，成功合成了 bPEI1.8K-C12；MTT 結(jié)果表明 bPEI1.8K-C12對人乳腺癌 MCF-7 細胞的毒性與bPEI1.8K相當；紅細胞溶血實驗結(jié)果表明高濃度 bPEI1.8K-C12靜脈注射時具有潛在溶血性；質(zhì)量比相同時，bPEI1.8K-C12/ DNA 復合顆粒的平均粒徑和 zeta 電位均比相應的 bPEI1.8K/DNA 大；烷基化修飾后，bPEI1.8K-C12對 DNA 的固縮能力降低，MCF-7 細胞對 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的攝取效率大大增加，bPEI1.8K-C12遞送報告基因質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染效率顯著高于 bPEI1.8K，甚至與 lipofectamine2000 相當。

bPEI1.8K-C12是一種安全高效的基因遞送載體，具有較高的進一步開發(fā)前景。

聚乙烯亞胺； 抗腫瘤藥，烷基化； 基因遞送； 基因療法

基因療法[1-2]是一種治療多種先天和后天疾病的有力工具，其在腫瘤治療中的應用方興未艾。如何實現(xiàn)基因藥物安全有效的體內(nèi)遞送是基因治療的一大技術瓶頸。目前常用的基因遞送載體可以分為重組病毒載體和人工合成載體（非病毒載體）。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但是制備及純化困難，攜載基因容量小，且具有潛在致病性。非病毒載體被認為是比病毒載體更理想的基因藥物輸送載體。在眾多非病毒載體中，聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）是目前研究最廣泛的聚陽離子非病毒載體[3]。然而，未經(jīng)改性的 PEI 存在轉(zhuǎn)染活性-毒性的相互制約關系，即 PEI 分子量越大，轉(zhuǎn)染活性越高，但同時毒性也越大。

目前，各國學者正致力于 PEI 的化學改性；現(xiàn)有研究多是針對高分子量 PEI，如采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、肝素、透明質(zhì)酸、PEG 等對 PEI 進行化學改性，提高其轉(zhuǎn)染活性的同時降低毒性；而對小分子量 PEI 的化學改性研究相對較少。普遍認為低分子量的 PEI（Mw ≤ 2000）細胞毒性較小，但其轉(zhuǎn)染效率低下。麻省理工大學的 Klibanov 和 Thomas 研究小組對分子量為 2000 的 PEI 進行烷基化修飾[4]，發(fā)現(xiàn)其在有血清條件下的轉(zhuǎn)染效率是修飾前的 400 倍，是體外轉(zhuǎn)染金標準（分子量為 25 000 的分枝狀 PEI）的6 倍，說明低分子量 PEI 通過一定的化學改性也可以成為安全、高效的基因遞送載體，但該研究并未對烷基化低分子量 PEI 作為基因遞送載體的理化特征進行深入研究。本研究選擇對分子量為 1800 的分枝狀 PEI（bPEI1.8K）進行烷基化修飾，并考察了烷基化修飾后的 bPEI1.8K-C12作為基因遞送載體的安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 bPEI1.8K（99%）為Alfa Aesar 天津化學有限公司產(chǎn)品；1-溴十二烷（99%）、MTT、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、異硫氰酸熒光素（FITC）均為美國Sigma 公司產(chǎn)品；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）為美國 Hyclone 公司產(chǎn)品；HBS 緩沖液（20 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，pH = 7.4）自制；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 分析電子天平購自瑞士 Mettler Toledo 儀器公司；數(shù)顯加熱磁力攪拌器購自德國 IKA 公司；R210/R215 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自瑞士 Buchi 公司；Zetasizer Nano ZS 型激光粒度測定儀購自英國 Malvern 公司；Nicomp-380 型激光粒度儀購自美國 PSS 公司；Bio-Best 135A 型凝膠成像儀購自美國 Simon 公司；TCS-SP2 型激光共聚焦顯微鏡購自德國 Leica 公司；Glomax 生物發(fā)光檢測儀購自美國 Promega 公司；Spectra Max 190 型酶標儀購自美國 MD 公司；IX71 倒置熒光顯微鏡購自日本 Olympus 公司。

1.1.3 細胞 人乳腺癌細胞株 MCF-7 購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所；37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于添加有 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基中，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2 方法

1.2.1 烷基化 bPEI1.8K（bPEI1.8K-C12）的合成與鑒定[5]稱取 bPEI1.8K1 g溶于 100 ml 二氯甲烷和甲醇（V/V 為 95:5）的混合溶劑中，在30 ℃下攪拌溶解。稱取 1-溴十二烷 0.7245 g 溶于 50 ml 的二氯甲烷和甲醇（V/V 為 95:5）的混合溶劑中，以 10 ml/h 的速度滴加至上述聚乙烯亞胺溶液中，在40 ℃下，避光反應 24 h；旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑得到淡黃色半固體膏狀物，將其混懸于 6 ml 蒸餾水中，然后用截留分子量為 1000 的透析袋在 40% 的乙醇溶液中透析 6 次，再在去離子水中透析 24 h，將透析后得到的物質(zhì)冷凍干燥 48 h 后，制得 bPEI1.8K-C12。取凍干后 bPEI1.8K-C12約15 mg 溶解于約 0.6 ml 重水中，采用 400 MHz 的核磁共振氫譜（1H-NMR）進行結(jié)構(gòu)確認。

1.2.2 體外細胞毒性實驗 將 MCF-7 細胞以5 × 103個/孔密度接種于 96 孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基，分別加入含 5 或 10 μg/ml bPEI1.8K-C12的 DMEM 培養(yǎng)基（含 10% FBS）200 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 24 或 48 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔分別加入含 0.5 mg/ml 的 MTT 的培養(yǎng)基 100 μl 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，吸棄溶液，加入 150 μl DMSO 溶解甲瓚結(jié)晶，然后用酶標儀測定各孔在 570 nm 處的值，以未加藥物作用的孔的值作為對照，計算MCF-7 細胞在不同作用時間和不同bPEI1.8K-C12濃度條件下的存活率，每組實驗設置4 個重復孔。

1.2.3 溶血實驗 將經(jīng)過肝素處理的新鮮收集的大鼠紅細胞用 pH 7.4 等滲 PBS 離心洗滌 3 個循環(huán)，然后用 pH 7.4 HBS 緩沖液將紅細胞稀釋成濃度為 1 × 109個/ml 紅細胞懸液，分別取 75 μl 上述紅細胞懸液與 75 μl 含不同濃度 bPEI1.8K-C12的 pH 7.4 HBS 溶液混合，37 ℃振蕩 60 min，離心后取 80 μl 上清液測定血紅蛋白的濃度（450 nm），分別以 pH 7.4 HBS 和 1% triton X-100 為陰性對照和陽性對照，計算各濃度 bPEI1.8K-C12的紅細胞裂解效率。

1.2.4 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的制備 依照 bPEI1.8K-C12與 DNA 的質(zhì)量比，將 20 ng/μl 的熒光素酶報告基因質(zhì)粒 pGL4.5 的 HBS 溶液與等體積含不同濃度 bPEI1.8K-C12的 HBS 溶液混勻后，室溫孵育 20 min，得到 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒。

1.2.5 瓊脂糖凝膠阻滯電泳 依照上述 PEI/DNA 復合顆粒的制備方法，制備和bPEI1.8K-C12與 pGL4.50 質(zhì)粒的質(zhì)量比分別為 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 的 bPEI1.8K/DNA 和 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒。將制備好的不同質(zhì)量比的復合顆粒與適量上樣緩沖液混合后加樣于 1% 瓊脂糖凝膠中，80 V 條件下電泳 60 min，然后在 0.5 μg/ml 溴化乙錠（EtBr）溶液中染色 30 min，采用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.2.6 粒徑及 zeta 電位測定 依照上述方法制備 bPEI1.8K-C12與 pGL4.50 質(zhì)粒的質(zhì)量比分別為 1、5、10、15、20 的 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒。將復合顆粒適度稀釋后，制備介質(zhì)和稀釋介質(zhì)均為 pH 7.4 的 HBS 緩沖液，最后采用激光粒度測定儀測定各復合顆粒的粒徑分布及 zeta 電位。

1.2.7 細胞攝取試驗 將 MCF-7 細胞以 5 ×104個/孔密度接種于鋪有無菌圓形蓋玻片的 24 孔板中，培養(yǎng) 24 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基，分別用無血清 DMEM 培養(yǎng)基洗 2 次后，用不含血清的 DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃預培養(yǎng) 1 h 后[6]，吸棄舊培養(yǎng)基，然后每孔分別加入含 FITC 標記的 bPEI1.8K/DNA 或 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的無血清 DMEM 培養(yǎng)基 200 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基，用冷 PBS 洗滌細胞 3 次，細胞用 4% 多聚甲醇固定 10 min，冷 PBS 洗滌細胞3 次，細胞核用5 μg/ml 的 Hoechst33258 37 ℃染色 15 min 后，用冷 PBS 洗滌細胞 3 次，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞攝取情況。

1.2.8 體外細胞轉(zhuǎn)染 采用熒光素酶報告基因質(zhì)粒（pGL4.50）考察體外轉(zhuǎn)染效率。將 MCF-7 細胞以 5 × 103個/孔的密度接種于 96 孔中。依照上述方法制備質(zhì)量比分別為 1:1、3:1、5:1 的 bPEI1.8K/pGL4.50 和 bPEI1.8K-C12/pGL4.50 復合顆粒。96 孔板中細胞培養(yǎng) 24 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌 2 次，每孔加入 80 μl 含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，然后每孔加入含有 100 ng pGL4.50 的復合顆粒溶液 20 μl，每組設置 4 個復孔。培養(yǎng) 24 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基，用 PBS 洗2 次，每孔加入 1 × 細胞裂解液 20 μl，37 ℃振搖 15 min 后，每孔取 10 μl 裂解液加入 50 μl 熒光素酶底物，用發(fā)光檢測儀測定每孔熒光素酶活力，計算轉(zhuǎn)染效率，同時用 BCA 蛋白定量試劑盒測定每孔的蛋白含量，最終計算每孔單位蛋白含量的熒光素酶的表達（每毫克蛋白的熒光素酶活力）。以 lipofectamine2000 作為陽性對照。

采用綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒pEGFP 考察體外轉(zhuǎn)染效率。將 MCF-7 細胞以 4 × 104個/孔的密度接種于 24 孔中。依照上述方法制備質(zhì)量比為 5:1 的 bPEI1.8K/pEGFP 和 bPEI1.8K-C12/pEGFP 復合顆粒。24 孔板中細胞培養(yǎng) 24 h 后，吸棄舊培養(yǎng)基，用 PBS 洗滌 2 次，每孔加入 160 μl 含 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基，然后每孔加入含有 400 ng pEGFP 的復合顆粒溶液 40 μl。培養(yǎng) 24 h 后，采用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達。以 lipofectamine2000 作為陽性對照，每組設置 3 個復孔。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 bPEI1.8K-C12的合成與鑒定

采用 1-溴十二烷對 bPEI1.8K進行烷基化修飾，bPEI1.8K-C12的1H-NMR 圖譜見圖 1。從圖 1 可知，化學位移 2.5 ~ 2.9 ppm 區(qū)段的寬峰歸屬于 bPEI1.8K母體中的氫；化學位移 0.92 ppm 和 1.31 ppm 處的寬單峰分別歸屬于（-CH3）和 -(CH2)11-，表明十二烷基已成功接枝于 bPEI1.8K上。理論上，圖 1 中，化學位移 0.92 ppm（-CH3）和 1.31 ppm（-(CH2)11-）處的峰應為多重峰，但是由于 bPEI1.8K-C12為高分子聚合物，其核磁氫譜譜圖中的特征峰沒有小分子化合物那么典型；且本文采用的是 400 MHz 核磁，在這種電磁輻射頻率條件下，由于靈敏度限制，沒有觀察到精細的峰裂分（多重峰）。根據(jù)圖 1 中歸屬于 CH3和 bPEI 各峰的峰面積比值[7]，計算得出 bPEI1.8K-C12中十二烷基（C12）的取代度為 13.44。

圖 1 bPEI1.8K-C12的核磁氫譜圖

Figure 11H-NMR of bPEI1.8K-C12

2.2 bPEI1.8K-C12體外細胞毒性實驗

為了評價 bPEI1.8K-C12遞送質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞的效率，為以后應用 bPEI1.8K-C12遞送功能性質(zhì)粒 DNA 治療乳腺癌奠定基礎。采用 MTT法考察 bPEI1.8K-C12對人乳腺癌細胞株 MCF-7 細胞的毒性[8]，并與未修飾的 bPEI1.8K進行比較，結(jié)果見圖 2。從圖 2 可知，10 μg/ml 的 bPEI1.8K-C12作用 MCF-7 細胞 48 h 后，細胞活力略有降低（84%），但與相應條件下的 bPEI1.8K相比，兩者對MCF-7 細胞活力的影響并無顯著性差異（> 0.05）；5 μg/ml 的 bPEI1.8K-C12作用MCF-7 細胞 24 或 48 h 對其細胞活力的影響與未修飾的bPEI1.8K相當，MCF-7 細胞的增殖能力幾乎不受影響。另外，在體外轉(zhuǎn)染中，當 bPEI1.8K-C12與 DNA 的質(zhì)量比為 5:1 時，bPEI1.8K-C12實際作用細胞的濃度為5 μg/ml，在整個 24 h 轉(zhuǎn)染過程中，MCF-7 細胞均可保持很好的細胞活力。以上結(jié)果說明，烷基化修飾并未增加 bPEI1.8K的毒性，bPEI1.8K-C12作為基因遞送載體具有很高的安全性。

細胞活力（%）Cell viability (%)120 100 80 60 40 20 0 5 μg/ml（24 h）10 μg/ml（24 h）5 μg/ml（48 h）10 μg/ml（48 h） bPEI1.8K bPEI1.8K-C12

Figure 2 Cytotoxicity of bPEI1.8K-C12and bPEI1.8Kon MCF-7 cells

2.3 溶血實驗

采用大鼠紅細胞的溶血實驗檢測 bPEI1.8K-C12裂解紅細胞膜的能力[9]，考察 bPEI1.8K-C12的生物相容性，評價其體內(nèi)應用安全性。由表 1 可知，bPEI1.8K-C12和 bPEI1.8K的紅細胞裂解效率均呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，隨著濃度的增大，兩者的紅細胞裂解效率均有不同程度的提高，且 bPEI1.8K-C12紅細胞裂解效率隨濃度增大的趨勢比 bPEI1.8K強；另外，在相同濃度條件下，bPEI1.8K-C12的紅細胞裂解效率比 bPEI1.8K高，但兩者之間并不存在顯著性差異（> 0.05）。以上結(jié)果說明，體內(nèi)經(jīng)靜脈系統(tǒng)注射高濃度 bPEI1.8K-C12具有一定的潛在溶血性，在不影響轉(zhuǎn)染效率的前提下，應盡量使用較低濃度的 bPEI1.8K-C12。

2.4 瓊脂糖凝膠阻滯電泳

烷基化修飾后，會使 bPEI1.8K的部分伯胺變?yōu)橹侔坊档推潆姾擅芏群蛯?DNA 的固縮能力。采用瓊脂糖凝膠電泳分別考察 bPEI1.8K和 bPEI1.8K-C12對質(zhì)粒 DNA 的固縮能力，結(jié)果見圖 3。從圖 3 可知，要完全固縮（包裹）DNA，bPEI1.8K和 bPEI1.8K-C12與 DNA 的最小質(zhì)量比應分別為 0.4和 0.8。以上結(jié)果表明烷基化修飾減弱了 bPEI1.8K固縮 DNA 的能力，這與文獻[10]研究結(jié)果一致。

2.5 粒徑及 zeta 電位測定

bPEI1.8K-C12/DNA 和 bPEI1.8K/DNA 復合顆粒在不同質(zhì)量比時的粒徑分布和 zeta 電位結(jié)果見表 2。從表 2 可知，隨著質(zhì)量比的增大，bPEI1.8K- C12/DNA 和bPEI1.8K/DNA 復合顆粒的平均粒徑和 zeta 電位都逐漸增大，當質(zhì)量比≥ 15 時，兩者的平均粒徑和 zeta 電位都趨于恒定。另外，當質(zhì)量比相同時，bPEI1.8K-C12/DNA 的平均粒徑均高于同條件下的 bPEI1.8K/DNA，更進一步印證了烷基化修飾后，bPEI1.8K-C12對 DNA 的固縮能力比 bPEI1.8K低。另外，bPEI1.8K-C12/DNA 的 zeta 電位均比相應條件下 bPEI1.8K/DNA 高，且當質(zhì)量比≥ 5 時，bPEI1.8K-C12/DNA 的 zeta 電位的平均值大大高于 bPEI1.8K/DNA，提示 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒在溶液中具有較高的穩(wěn)定性。

2.6 細胞攝取試驗

PEI/DNA 復合顆粒能被細胞有效攝取是其實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染的先決條件，因此用 FITC 分別對bPEI1.8K和 bPEI1.8K-C12進行熒光標記[11]，依照前述方法分別制備bPEI1.8K/DNA 和 bPEI1.8K-C12/ DNA 復合顆粒，采用激光共聚焦顯微鏡觀察了PEI/DNA 復合顆粒的細胞攝取情況。從圖 4 可知，轉(zhuǎn)染 4 h 后，MCF-7 細胞對bPEI1.8K/DNA 復合顆粒的攝取量很低，細胞內(nèi)僅有少量的綠色熒光；而 MCF-7 細胞對bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的攝取量大大增加，細胞內(nèi)可見大量蓄積的綠色熒光，并且部分綠色熒光位于細胞核中。以上結(jié)果表明，烷基化修飾大大增加了細胞對 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的攝取效率。烷基化修飾后，增加了 bPEI1.8K的疏水性，從而提高了 bPEI1.8K-C12與細胞膜的親和力[12]，使 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒更易被細胞攝取。

表 1 bPEI1.8K-C12和 bPEI1.8K的紅細胞裂解效率（%）

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 AB

Figure 3 Gel retardation assay of bPEI1.8K-C12and bPEI1.8K(A: bPEI1.8K; B: bPEI1.8K-C12; 1: 1000 bp DNA marker; 2: Naked DNA; 3: w/w=0.1; 4: w/w=0.2; 5: w/w=0.4; 6: w/w=0.6; 7: w/w=0.8; 8: w/w=1.0)

表 2 bPEI1.8K-C12/DNA 和 bPEI1.8K/DNA 復合顆粒的粒徑和 zeta 電位

圖 4 bPEI1.8K/DNA（A）和 bPEI1.8K-C12/DNA（B）復合顆粒的細胞攝取

Figure 4 Cellular uptakes of bPEI1.8K/DNA (A) and bPEI1.8K- C12/DNA (B) polyplexes

2.7 體外細胞轉(zhuǎn)染

本研究分別采用兩種報告基因（熒光素酶基因質(zhì)粒 pGL 4.50 和綠色熒光蛋白基因質(zhì)粒pEGFP）考察 bPEI1.8K-C12在有血清條件下遞送質(zhì)粒 DNA 的體外轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果分別見圖 5、6。從圖 5 可知，分別用三種質(zhì)量比的 bPEI1.8K/DNA 復合顆粒轉(zhuǎn)染 MCF-7 細胞 24 h 后，細胞內(nèi)的熒光素酶表達量均很低；而當用質(zhì)量比為 3:1 和 5:1 的bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒轉(zhuǎn)染細胞時，細胞內(nèi)的熒光素酶表達量顯著增加，甚至略高于市售lipofectamine2000 組的胞內(nèi)熒光素酶表達量。當采用 pEGFP 報告基因考察 bPEI1.8K-C12體外轉(zhuǎn)染效率時，bPEI1.8K-C12可以使 pEGFP 在細胞內(nèi)高效表達（圖 6），其轉(zhuǎn)染效率與市售 lipofectamine2000 相當。以上結(jié)果表明，烷基化修飾大大增強了 bPEI1.8K-C12遞送質(zhì)粒DNA 的體外轉(zhuǎn)染效率。

熒光素酶活力（U/μg）Luciferase activity (U/μg)1.5 × 106 1.0 × 106 0.5 × 106 0 1:1 3:1 5:1 1:1 3:1 5:1 lipo bPEI1.8K bPEI1.8K-C12 2000

Figure 5 Luciferase activity of MCF-7 cells 24 h post-transfection with bPEI1.8K/DNA and bPEI1.8K-C12/DNA polyplexes encoding luciferase (*Compared with bPEI1.8Kof the same weight ratio,< 0.01)

圖 6 MCF-7 細胞轉(zhuǎn)染bPEI1.8K-C12/DNA（A）和 lipofectamine2000/DNA（B）復合顆粒 24 h 后的綠色熒光表達

Figure 6 GFP expression in MCF-7 cells 24 h post- transfection with bPEI1.8K-C12/DNA polyplexes (A) and lipofectamine2000/DNA lipoplexes (B)

3 討論

本研究采用十二烷基接枝低分子量 PEI，得到烷基化修飾的 bPEI1.8K-C12，初步考察了 bPEI1.8K- C12作為基因遞送載體的安全性和有效性。體外增殖抑制實驗的結(jié)果表明，烷基化修飾后，bPEI1.8K- C12很好地保留了 bPEI1.8K的低毒性；但是溶血實驗的結(jié)果提示高濃度 bPEI1.8K-C12體內(nèi)系統(tǒng)給藥時具有潛在溶血可能性。因此，為了保證安全性，bPEI1.8K-C12可以局部注射給藥；或者進一步通過 PEG、PLGA、肝素或殼聚糖等化學修飾或 PLGA 物理包裹等方式提高其生物相容性，以便經(jīng)靜脈系統(tǒng)給藥。

瓊脂糖凝膠阻滯電泳的結(jié)果表明，烷基化修飾后，bPEI1.8K-C12對 DNA 的固縮能力降低了。另外，bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的平均粒徑比相應 bPEI1.8K/DNA 的平均粒徑大，也間接佐證了烷基化修飾降低了 bPEI1.8K與 DNA 的固縮能力。現(xiàn)有研究表明，PEI 的轉(zhuǎn)染效率與其對 DNA 的固縮能力之間并不存在直接的必然聯(lián)系，只有當 PEI 與 DNA 維持一個理想的離解/固縮平衡，即 PEI 能在細胞外穩(wěn)定固縮 DNA，且能在細胞內(nèi)有效離解 DNA才可以達到較高的轉(zhuǎn)染效率[13]。bPEI1.8K-C12固縮 DNA 的能力雖然比 bPEI1.8K弱，但是 bPEI1.8K-C12的體外基因轉(zhuǎn)染效率卻顯著高于 bPEI1.8K，甚至與市售轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine2000 相當。bPEI1.8K-C12體外基因轉(zhuǎn)染效率高的原因可能有以下三點：①烷基化修飾增強了 bPEI1.8K-C12與細胞膜的親和力，使細胞對 bPEI1.8K-C12/DNA 復合顆粒的攝取效率大大增加；②在細胞內(nèi)，DNA 能更有效地從 bPEI1.8K-C12/DNA 中離解出來；③復合顆粒 zeta 電位的絕對值遠遠大于 bPEI1.8K/DNA，bPEI1.8K-C12/DNA 在轉(zhuǎn)染介質(zhì)（含血清 DMEM）中具有更高穩(wěn)定性。

單一材料或者制劑方法已無法滿足將基因藥物安全高效遞送入體內(nèi)的需求，現(xiàn)在多采用復合材料或組合制劑技術來實現(xiàn)這一目標。就分子量而言，與高分子量 PEI 相比，低分子量 PEI 更便于與其他材料構(gòu)成復合材料或與功能配基鍵合，或?qū)EI 與 DNA 的靜電復合方法與其他制劑技術整合構(gòu)建多功能劑型[7]，如逐層自組裝[14]。本文構(gòu)建的 bPEI1.8K-C12基因轉(zhuǎn)染效率高，毒性低，且制備方法簡單，將其作為一種制劑中間體，有望開發(fā)出有前景的復合材料或組合制劑技術。

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Alkylated low molecular polyethylenimine as a gene delivery vector

LIU Shan, HUANG Wei, JIN Ming-ji, QUAN Xiu-quan, GAO Zhong-gao

Preliminary evaluation of the safety and efficiency of alkylated low molecular polyethylenimine as a gene delivery vector.

bPEI1.8K-C12was synthesized with branch PEI (Mw 1800; bPEI1.8K) and 1-bromododecane, and structurally confirmed with1H-NMR. Cytotoxicity and biocompatibility of bPEI1.8K-C12were evaluated by MTT method and hemolysis assay, respectively. Size distribution and zeta potential of bPEI1.8K-C12/DNA polyplexes were determined, and cellular uptake of the DNA polyplexes was visualized with confocal laser scanning microscope (CLSM). DNA condensation ability of bPEI1.8K-C12was studied by gel retardation assay, andgene delivery efficiency was investigated with luciferase and green fluorescent protein reporter gene, respectively.

bPEI1.8K-C12was successfully synthesized after confirmation by1H-NMR. Cytotoxicity of bPEI1.8K-C12on MCF-7 cells was as low as bPEI1.8K, and systematic delivery of high dose bPEI1.8K-C12may cause hemolysis. The average size of bPEI1.8K-C12/DNA polyplexes was bigger than that of bPEI1.8K/DNA polyplexes at the same weight ratio, and the zeta potential of bPEI1.8K-C12/DNA polyplexes was higher than that of bPEI1.8K/DNA polyplexes at the same weight ratio. After alkylation, the DNA condensation ability of bPEI1.8K-C12was reduced, but the cellular uptake of bPEI1.8K-C12/DNA polyplexes was greatly enhanced.gene transfection efficiency of bPEI1.8K-C12/DNA was significantly higher than that of bPEI1.8K, and was comparable to that of lipofectamine2000.

bPEI1.8K-C12is a safe and efficient gene delivery vector, and holds great promise for further development.

Polyethyleneimine; Antineoplastic agents, alkylating; Gene delivery; Gene therapy

GAO Zhong-gao, Email: zggao@imm.ac.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.003

北京市自然科學基金（7142114、2141004）；國家自然科學基金（81373342）；協(xié)和青年科研基金學生創(chuàng)新項目（2012-1007- 017）

高鐘鎬，Email：zggao@imm.ac.cn

2014-03-11

Author Affiliations: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Functioins of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (LIU Shan, HUANG Wei, JIN Ming-ji, GAO Zhong-gao); Department of Respiratory Medicine, The Affiliated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, China (QUAN Xiu-quan)