• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大麻素受體在大鼠視網膜中的表達和分布△

    2014-11-01 03:09:08汪書越李玲竹苗艷穎王中峰
    中國眼耳鼻喉科雜志 2014年4期

    汪書越 李玲竹 苗艷穎 王中峰

    大麻因具有治療和精神作用而被吸食應用達上千年之久。大麻是??浦参锎舐?cannabis sativa)的提取物,其有效活性成分是四氫大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinol,Δ9-THC)。自從發(fā)現(xiàn)Δ9-THC后,一系列與其功能相似的化合物被合成,這些化合物統(tǒng)稱為大麻素(cannbinoids)。在大麻素的研究過程中,一個重要的進展是在動物組織中發(fā)現(xiàn)大麻素的受體(cannbinoid receptor)。大麻素受體主要有CB1和CB22個亞型,均是7次跨膜的G蛋白耦聯(lián)受體,二者的氨基酸序列有44%的同源性[1]。CB1受體主要分布在中樞神經系統(tǒng),而CB2受體主要分布在免疫系統(tǒng)[2]。大麻素研究歷程中的另一個重要進展是內源性大麻素(endocannbinoid,eCB),即大麻素受體的內源性配體的發(fā)現(xiàn)。有代表性的內源性大麻素有2類:N-花生四烯酸氨基乙醇(arachidonylethablamide,anandamine,AEA)和 2-花生四烯酸甘油(2-arachidonyl glycerol,2-AG)。已有文獻[3-4]表明,廣泛表達在中樞神經系統(tǒng)的內源性大麻素系統(tǒng),通過作用于大麻素受體,調控多種生理功能,如影響學習記憶、痛覺感知、突觸傳遞和突觸可塑性等。

    越來越多的證據[5-6]表明,大麻素受體信號系統(tǒng)在脊椎動物視網膜中有廣泛分布。通過種屬特異的多克隆抗體,在人、獼猴、小鼠、大鼠、雞、金魚和虎螈的視網膜中均發(fā)現(xiàn)有CB1受體的表達[7-8]。大麻素受體的內源性配體AEA[9]和內源性大麻素水解酶脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolase,F(xiàn)AAH),在多種視網膜細胞上和內網狀層上均有表達[7-8,10]。這些結果提示,內源性大麻素可能調控多種視網膜神經元的功能,并且在視覺信息處理的多種神經回路中起作用。神經節(jié)細胞是視網膜的唯一輸出神經元,它整合視網膜的視覺信息,以動作電位的方式將信息輸送至視覺中樞。盡管有研究[5-6]發(fā)現(xiàn),多種動物視網膜神經節(jié)細胞有大麻素受體的表達,但對于CB1和CB2受體在大鼠視網膜神經節(jié)細胞上的分布特征和意義尚沒有完全闡釋清楚。本研究應用免疫組織化學等方法研究大麻素CB1、CB2受體在出生后1周、4周和12周大鼠視網膜組織,尤其是神經節(jié)細胞上的表達和分布情況,為進一步研究大麻素信號系統(tǒng)在視網膜網絡組織的功能奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 出生后1周、4周和 12周雄性Sprague-Dawley大鼠,購自上海斯萊克實驗動物中心,清潔級。本實驗所有動物實驗均遵守美國眼科與視覺研究協(xié)會(ARVO)和復旦大學實驗動物飼養(yǎng)管理及動物使用規(guī)定。實驗中盡量減輕動物疼痛和不適,飼養(yǎng)溫度維持在21℃,12 h光照/黑暗循環(huán)照明,給予充足的水、飼料和活動空間。

    1.2 視網膜神經節(jié)細胞的上丘逆行追蹤標記 參照先前的實驗[11]進行。采用了在上丘注射霍亂毒素B亞基(cholera toxin subunit B,CTB)(List Biological Laboratories,USA)作為追蹤物的方法來逆行標記視網膜神經節(jié)細胞。具體操作如下:大鼠后肢肌內注射氯氨酮(25 mg/kg)和甲苯噻嗪(10 mg/kg)混合劑全身麻醉后,上好耳桿,然后將其頭部固定在立體定位儀(SR-6R,Narishige,Tokyo,Japan)上,全程注意監(jiān)測其呼吸和體溫。用0.5%聚維酮碘消毒皮膚,于正中切開皮膚,向下分離達顱骨,暴露顱骨,在骨縫交合處尋找Bregma點,然后以Bregma點向后6 mm、旁開2 mm、4~5 mm深度的位置定位上丘。用骨鉆在雙側上丘相對應顱骨處小心打孔。用微量注射器在上丘位置分別注入2 μL 1%的 CTB溶液。緩慢注射,在6 min內完成。然后,緩慢取出微量注射器,用凝膠海綿堵塞顱骨上的鉆孔,消毒并縫合顱頂皮膚。在逆行標記第5~6天處死動物,取出眼球,固定后切片。

    1.3 視網膜標本制備 參考之前的工作[11-12]進行。用25%烏拉坦腹腔注射深度麻醉大鼠,迅速摘取眼球,浸入4%多聚甲醛溶液中,4℃固定2 h。依次在10%和20%蔗糖溶液中分別浸泡2 h,30%蔗糖溶液中4℃過夜梯度脫水。最后在角鞏膜緣下約2 mm處環(huán)形切開,眼科剪環(huán)剪1周。棄去角膜、晶狀體以及玻璃體的前半部分,將眼杯用最佳切削溫度(optimal cutting temperature,OCT)(Miles Inc.,Elkhart,IN,USA)包埋劑包埋,再在冰凍切片機(Leica,Nussloch,Germany)沿垂直方向進行連續(xù)切片,片厚14 μm,依次收集于經預處理的玻片(Fisher,USA)上,儲存于-20℃冰箱備用。

    1.4 免疫熒光組織化學 將切片從-20℃冰箱取出,恢復至室溫后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline,PBS)漂洗5 min×3次。之后,置于含有3%正常驢血清、0.5%小牛血清和0.2%Triton X-100的PBS置于室溫孵育2 h,以降低非特異性背景染色。然后加入一抗反應液,置于4℃冰箱孵育過夜。次日,用PBS漂洗10 min×3次以充分洗去未結合的一抗,加入對應的二抗,室溫孵育2 h后,PBS漂洗3×15 min后,加入DAPI(1∶1000,Sigma)封片劑封片。在實驗中用到的一抗有:羊抗 CTB多克隆抗體 (1∶2000,List Biological Laboratories,USA),小鼠抗Brn3單克隆抗體(1∶100,Santa Cruz,USA),兔抗 CB1 受體多克隆抗體(1∶300,Abcam,USA)和兔抗CB2受體多克隆抗體(1∶200,Sigma,USA)。二抗有488-耦聯(lián)的驢抗羊或驢抗 鼠 IgG (1∶800,Jackson Immuno Research Laboratories,USA)和 Cy3-耦聯(lián)的驢抗兔 IgG(1∶200,Jackson Immuno Research Laboratories,USA)。

    經過免疫熒光反應的視網膜切片在共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察(Olympus,放大400倍)。對準備好的標本進行單層光學切片掃描并數(shù)字化記錄,數(shù)據保存到電腦上。為了避免由于重塑產生疊加偽跡的可能性,在雙標實驗中對單層光學切片進行次第掃描。所得到的圖片用Adobe Photoshop軟件加以適當?shù)恼{整和標注。

    1.5 Western印跡法分析 迅速分離大鼠視網膜或者腦組織,加適量RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑和含有磷酸酶抑制劑的 cocktail(Roche Applied Science,Mannheim,Germany)。經超聲破碎儀(ultrasonic cell prosessor,Ningbo,China)破碎細胞后,以相對離心力15294×g,4℃ 離心30 min。收集離心后蛋白上清液,按4∶1加入5×上樣緩沖液,煮沸6 min后,迅速放冰上冷卻后于-40℃?zhèn)溆?。將已制備好的蛋白樣品加?0%SDS-PAGE上的梳孔中,然后利用Mini-PROTEAN 3電泳系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在120 V恒壓條件下電泳90 min左右,從而將視網膜蛋白按相對分子質量大小在PAGE上依次分離開,在分離膠左上角做標記。之后再用 Mini Trans-Blot電轉系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)在恒流300 mA條件下轉膜2 h,將蛋白從 PAGE上轉印到 PVDF膜(Immobilon-P,Millipore,Billerica,Massachusetts,USA)上。待轉印完成之后,用封閉液(含5%脫脂奶粉和0.05%Tween 20的TBS)室溫下封閉轉移后的 PVDF膜1 h。用1×TBST溶液適當漂洗之后,將PVDF膜轉移到待檢目的蛋白的抗體反應液中,置4℃孵育過夜。次日,用1×TBST溶液漂洗3次之后,加入二抗并在室溫下孵育2 h。將二抗在1×TBST溶液漂洗3次,每次15 min后,將 PVDF膜用 Alpha凝膠成像儀 FluorChemE(ProteinSimple,USA)進行掃描并且獲得圖像。實驗中用到的一抗為單克隆鼠抗β-actin(1∶1000,Sigma,USA);兔抗CB1受體多克隆抗體 (1∶300,Abcam,USA);兔抗 CB2受體多克隆抗體 (1∶250,Sigma,USA);二抗為IRDye 800CW 驢抗兔IgG(1∶10000;LI-COR Biosciences,USA)和 IRDye 800CW 驢抗鼠IgG(1∶10000;LI-COR Biosciences,USA)。

    2 結果

    2.1 CB1受體在成年大鼠視網膜的表達與分布 在成年(4周齡)大鼠視網膜垂直切片的免疫組織化學染色結果顯示,CB1受體的免疫熒光信號(紅色)廣泛分布于視網膜(圖1A)。在外核層(outer nuclear layer,ONL)、內核層(inner plexiform layer,INL)和神經節(jié)細胞層(ganglion cell layer,GCL),CB1受體陽性信號較強,且與細胞核的DAPI信號(藍色)重疊,說明這些CB1受體表達在細胞上;在突觸豐富的外網狀層(outer plexiform layer,OPL)和內網狀層(inner plexiform layer,IPL)也有較多的CB1受體陽性信號,說明在視網膜的細胞突起上也有CB1受體分布(圖1A)。當CB1受體的抗體被相應的免疫抗原(Abcam,Cambridge,MA,USA)預先結合后,則檢測不到任何陽性熒光信號(圖1B),表明我們所用CB1受體的抗體是特異的。

    在CTB逆行標記的大鼠視網膜垂直切片中,利用免疫熒光雙標技術發(fā)現(xiàn),GCL的CTB陽性神經節(jié)細胞(綠色,圖1C)均被CB1受體的抗體所共標(紅色,圖1D)。從疊加后的圖中可以清楚地看到,CTB所標記的視網膜神經節(jié)細胞全都是CB1受體免疫陽性的(如圖1E中的4個小箭頭所示)。此外,我們也觀察到,有些CTB陰性的神經細胞也同樣是CB1受體陽性的(如圖1E中的大箭頭所示),這些細胞可能是異位的無長突細胞。

    為了進一步驗證CB1受體在大鼠視網膜的表達,我們利用Western印跡法檢測了大鼠視網膜CB1受體蛋白的表達。如圖1F所示,視網膜組織抽提蛋白的Western印跡法結果呈單一條帶(約45×103)。同時,我們用大鼠的大腦皮質蛋白提取物進行同樣的實驗,也得到了相同的單一條帶。這些結果證明了大鼠視網膜組織表達CB1受體,而且也證明了我們所用的CB1受體抗體的特異性。

    圖1.大麻素CB1受體在大鼠視網膜的表達和分布

    2.2 CB2受體在成年大鼠視網膜的表達與分布 大鼠視網膜垂直切片的免疫組織化學染色結果顯示,CB2受體的免疫熒光信號(紅色)在視網膜各層均有分布(圖2A),其中在GCL、INL和ONL的細胞膜上有豐富的陽性信號,而且OPL和IPL也有廣泛的CB2受體陽性信號。此外,在Müller膠質細胞的終足和突起上也觀測到CB2受體的陽性信號(圖2A)。當用相應的免疫抗原(Abcam,Cambridge,MA,USA)預吸附CB2受體的抗體,則在視網膜組織檢測不到任何CB2受體的陽性熒光信號(圖2B),證明了所用的CB2受體抗體的特異性。

    在CTB逆行標記的大鼠視網膜垂直切片上,利用免疫熒光雙標技術發(fā)現(xiàn),在GCL所有CTB標記的神經節(jié)細胞(綠色,圖2C),均可被CB2抗體標記(紅色,圖2D)。圖2E顯示兩者疊加后的圖像,可清楚看到,CTB所標記的視網膜神經節(jié)細胞全都是CB2受體免疫陽性的(如圖2E中的小箭頭所示)。在GCL中個別CTB陰性的細胞也可被CB2受體抗體標記,這些細胞可能是異位的無長突細胞。

    Western印跡法結果顯示,大鼠視網膜和大腦皮質組織均有CB2受體蛋白的表達,而且呈單一的條帶,證明了其抗體的特異性(圖2F)。

    圖2.大麻素CB2受體在大鼠視網膜的表達和分布

    2.3 CB1和CB2受體在幼年和老齡大鼠視網膜的表達與分布 進一步觀察了CB1和CB2受體在幼年(1周齡)和老齡(12周齡)大鼠視網膜組織的表達分布。如圖3A和3E所示,1周齡大鼠視網膜垂直切片的免疫組織化學染色結果顯示,CB1和CB2的免疫熒光信號(紅色)在視網膜各層均有分布,包括GCL、INL和ONL的細胞膜,以及OPL和IPL。由于在新生低齡大鼠的上丘注射CTB逆行標記視網膜神經節(jié)細胞存在困難,我們用神經節(jié)細胞的特異標記物Brn3取代CTB來標記視網膜神經節(jié)細胞。利用免疫雙標技術,在1周齡大鼠視網膜垂直切片上發(fā)現(xiàn),GCL的Brn3陽性神經節(jié)細胞(綠色,圖3B和3F)均被CB1或CB2受體的抗體所共標(紅色,圖3C和3G)。圖3D和3H顯示的是疊加后的圖片,可以清楚地看到Brn3所標記的視網膜神經節(jié)細胞幾乎都是CB1或CB2受體免疫陽性的(如圖3D和3H中的小箭頭所示)。

    在視網膜垂直切片的免疫組織化學染色結果顯示,CB1/CB2受體在老齡大鼠視網膜的表達分布與幼年和成年大鼠的相似,即在視網膜各細胞層(GCL、INL和ONL)以及突觸層(IPL和OPL)廣泛表達(紅色信號)(圖4A和4E)。在CTB逆行標記的12周齡大鼠視網膜垂直切片上,免疫熒光雙標結果發(fā)現(xiàn),在GCL幾乎所有CTB標記的神經節(jié)細胞(綠色,圖4B和4F),均可被CB1或CB2抗體標記(紅色,圖4C和4G)。從兩者疊加的圖4D和4H可清楚看到,CTB所標記的視網膜神經節(jié)細胞幾乎都是CB1或CB2受體免疫陽性的(如圖4D和4H中的小箭頭所示)。

    圖3.大麻素CB1和CB2受體在幼年(1周齡)大鼠視網膜的表達和分布

    圖4.大麻素CB1和CB2受體在老齡(12周齡)大鼠視網膜的表達和分布

    3 討論

    本文的研究結果發(fā)現(xiàn),大麻素受體的2個亞型(CB1和CB2)在幼年、成年和老齡大鼠視網膜組織豐富表達和分布,幾乎所有的神經節(jié)細胞均表達2種受體亞型,提示大麻素系統(tǒng)可能對神經節(jié)細胞的功能活動有重要的調控作用。

    CB1受體在視網膜中最早的細胞定位是通過原位雜交方法在胚胎大鼠視網膜實現(xiàn)的,CB1受體mRNA在多種視網膜細胞上均有表達[13],之后,在雞胚胎視網膜也發(fā)現(xiàn)有CB1受體mRNA的表達。通過種屬特異的多克隆抗體發(fā)現(xiàn),CB1受體表達在人、獼猴、小鼠、大鼠、雞、金魚和虎螈的視網膜大多數(shù)細胞及OPL和IPL。針對神經節(jié)細胞,CB1受體在除了魚以外的其他幾個物種視網膜上均有表達[7]。然而,關于CB1受體在大鼠視網膜神經節(jié)細胞表達的報道不盡一致。Yazulla等[8]報道,成年大鼠視網膜GCL細胞的胞體沒有檢測到CB1陽性信號,盡管在IPL的遠端有點狀陽性信號,但無法分辨細胞類型;其他實驗室則發(fā)現(xiàn),CB1受體在從新生到成年的大鼠神經節(jié)細胞均有表達[6-7],與此一致,我們利用免疫熒光雙標技術,在幼年、成年和老齡大鼠視網膜神經節(jié)細胞的胞體和突起上發(fā)現(xiàn)CB1受體的表達,而且在GCL,一些異位的無長突細胞也表達CB1受體。造成這種差異的原因可能是他們所用的抗體不同。Yazulla等[8]所用抗體是識別胞外C1-C14序列,而Zabouri等[6]的抗體是識別C1-C77序列。在本文中,我們所用的抗體是識別胞內416-472序列。

    關于CB2受體在視網膜表達和分布的研究相對較少。盡管利用原位雜交技術在胚胎大鼠視網膜沒有檢測到CB2受體 mRNA的存在[13],但后續(xù)的研究利用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和原位雜交技術在成年小鼠和大鼠視網膜檢測到廣泛分布的CB2受體mRNA[14]。最近,利用免疫組織化學技術研究發(fā)現(xiàn),在大鼠視網膜色素上皮、光感受器細胞內側片段、水平細胞、無長突細胞、GCL中的細胞和IPL的纖維上都有CB2受體的存在[15]。與此一致,我們也發(fā)現(xiàn)在幼年、成年和老齡大鼠視網膜有廣泛分布的CB2受體,而且從出生到老齡,其表達和分布相似,提示在出生后早期這些受體的發(fā)育已經基本完成。鑒于視網膜GCL細胞有較多的異位無長突細胞,我們利用CTB逆行標記或Brn3標記神經節(jié)細胞,并利用免疫熒光雙標技術,觀察到幾乎所有的大鼠視網膜神經節(jié)細胞均表達CB2受體。

    已有的研究[5]表明,在視網膜廣泛分布、激活的CB1受體對多種神經元的離子通道有抑制作用,可以調控視網膜對光信號的加工和處理。然而,有關CB1受體對視網膜神經節(jié)細胞功能的調控,目前資料還不多。利用膜片鉗技術在培養(yǎng)的大鼠神經節(jié)細胞上發(fā)現(xiàn),CB1受體激動劑濃度依賴性壓抑高電壓激活的鈣離子通道電流[10]。此外,激活CB1受體也對視網膜產生神經保護作用。例如:大麻素抑制人眼活化狀態(tài)的Müller細胞促炎癥細胞因子的產生和釋放,并提高抗炎介質的產生[16];CB1受體激動劑可以保護神經節(jié)細胞免受谷氨酸毒性的侵害以及由高眼壓造成的缺血和神經節(jié)細胞數(shù)目的減少[17]。因此,進一步研究大麻素受體對視網膜神經節(jié)細胞功能的調控,將有助于理解視覺信息在視網膜的加工和處理,以及該受體系統(tǒng)對視網膜神經元保護的機制。

    [1]Howlett AC,Barth F,Bonner Tl,et al.International Union of Pharmacology.XXVII.Classification of cannabinoid receptors[J].Pharmacol Rev,2002,54(2):161-202.

    [2]Munro S,Thomas KL,Abu-Shaar M.Molecular characterization of a peripheral receptor for cannabinoids[J].Nature,1993,365(6441):61-65.

    [3]Wilson RI,Nicoll RA.Endogenous cannabinoids mediate retrograde signalling at hippocampal synapses [J].Nature,2001,410(6828):588-592.

    [4]Chevaleyre V,Takahashi KA,Castillo PE.Endocannabinoid-mediated synaptic plasticity in the CNS[J].Annu Rev Neurosci,2006,29(1):37-76.

    [5]Yazulla S.Endocannabinoids in the retina:from marijuana to neuroprotection[J].Prog Retin Eye Res,2008,27(5):501-526.

    [6]Zabouri N,Bouchard J F,Casanova C.Cannabinoid receptor type 1 expression during postnatal development of the rat retina[J].J Comp Neurol,2011,519(7):1258-1280.

    [7]Straiker A,Stella N,Piomelli D,et al.Cannabinoid CB1 receptors and ligands in vertebrate retina:localization and function of an endogenous signaling system[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(25):14565-14570.

    [8]Yazulla S,Studholme KM,Mcintosh HH,et al.Immunocytochemical localization of cannabinoid CB1 receptor and fatty acid amide hydrolase in rat retina[J].J Comp Neurol,1999,415(1):80-90.

    [9]Devane WA,Hanus L,Breuer A,et al.Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor[J].Science,1992,258(5090):1946-1949.

    [10]Lalonde MR,Jollimore CA,Stevens K,et al.Cannabinoid receptormediated inhibition of calcium signaling in rat retinal ganglion cells[J].Mol Vis,2006,12:1160-1166.

    [11]Chen J,Miao Y,Wang XH,et al.Elevation of p-NR2A(S1232)by Cdk5/p35 contributes to retinal ganglion cell apoptosis in a rat experimental glaucoma model[J].Neurobiol Dis,2011,43(2):455-464.

    [12]Ji M,Miao Y,Dong LD,et al.Group I mGluR-mediated inhibition of Kir channels contributes to retinal Müller cell gliosis in a rat chronic ocular hypertension model[J].J Neurosci,32(37):12744-12755.

    [13]Buckley NE,Hansson S,Harta G,et al.Expression of the CB1 and CB2 receptor messenger RNAs during embryonic development in the rat[J].Neuroscience,1998,82(4):1131-1149.

    [14]Lu QJ,Straiker A,Lu QX,et al.Expression of CB2 cannabinoid receptor mRNA in adult rat retina[J].Vis Neurosci,2000,17(1):91-95.

    [15]López EM,Tagliaferro P,Onaivi ES,et al.Distribution of CB2 cannabinoid receptor in adult rat retina[J].Synapse,2011,65(5):388-392.

    [16]Krishnan G,Chatterjee N.Endocannabinoids alleviate proinflammatory conditions by modulating innate immune response in muller glia during inflammation[J].Glia,2012,60(11):1629-1645.

    [17]Nucci C,Gasperi V,Tartaglione R,et al.Involvement of the endocannabinoid system in retinal damage after high intracellular pressure-induced ischemia in rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(7):2997-3004.

    美女福利国产在线| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品久久久久久久电影| 久久久久久伊人网av| 卡戴珊不雅视频在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 大香蕉久久网| 美女主播在线视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 欧美精品亚洲一区二区| 在线观看人妻少妇| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av成人精品一二三区| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产精品欧美亚洲77777| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美 日韩 精品 国产| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男女边摸边吃奶| 啦啦啦在线观看免费高清www| 精品久久久精品久久久| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 女人久久www免费人成看片| 国产 一区精品| 成人影院久久| 亚洲精品第二区| 美女中出高潮动态图| 熟女电影av网| 亚洲精品色激情综合| 日韩欧美精品免费久久| 涩涩av久久男人的天堂| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 视频区图区小说| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久99热6这里只有精品| 赤兔流量卡办理| 中文天堂在线官网| 欧美性感艳星| 欧美3d第一页| 成人亚洲精品一区在线观看| 少妇人妻 视频| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 中文字幕制服av| 不卡视频在线观看欧美| www.色视频.com| 99久久综合免费| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 十八禁网站网址无遮挡| 99热网站在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 精品一区二区三卡| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产精品国产av在线观看| a级毛片在线看网站| 丰满乱子伦码专区| 在线免费观看不下载黄p国产| av专区在线播放| 日本黄大片高清| 日韩中文字幕视频在线看片| 黄色视频在线播放观看不卡| 一级毛片aaaaaa免费看小| 人妻夜夜爽99麻豆av| 777米奇影视久久| 99久国产av精品国产电影| 国产高清三级在线| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 五月天丁香电影| 国产淫语在线视频| 国产黄频视频在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲国产日韩一区二区| 看非洲黑人一级黄片| 国精品久久久久久国模美| 久久久久久人妻| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久久久视频综合| 熟女人妻精品中文字幕| 伦精品一区二区三区| 日本av免费视频播放| 久久久久久久精品精品| 99久久人妻综合| 久久久久久久久久人人人人人人| 七月丁香在线播放| 熟女人妻精品中文字幕| 免费看光身美女| 少妇人妻 视频| 一级毛片我不卡| 丝袜喷水一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 视频中文字幕在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 久久国产精品大桥未久av| 日日撸夜夜添| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 嫩草影院入口| av专区在线播放| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美精品一区二区大全| 黄色怎么调成土黄色| 久久久久久久大尺度免费视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| www.色视频.com| 久久国内精品自在自线图片| 男人添女人高潮全过程视频| 婷婷色综合大香蕉| 婷婷色综合www| 精品一区二区三卡| 91国产中文字幕| 亚洲情色 制服丝袜| 99热这里只有是精品在线观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲国产av影院在线观看| 一级毛片我不卡| 国产淫语在线视频| 欧美日韩在线观看h| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品欧美亚洲77777| 日本黄色片子视频| 亚洲成色77777| 成人国语在线视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品人妻熟女毛片av久久网站| www.色视频.com| 亚洲国产色片| 亚洲在久久综合| 人人妻人人澡人人看| av电影中文网址| 日韩电影二区| 国产 一区精品| 能在线免费看毛片的网站| 精品一区二区三卡| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲精品国产av成人精品| 青春草视频在线免费观看| freevideosex欧美| 一级毛片我不卡| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 日本色播在线视频| 免费观看的影片在线观看| 99久久精品一区二区三区| 日本与韩国留学比较| 黄色毛片三级朝国网站| 日韩视频在线欧美| 日韩精品有码人妻一区| 少妇 在线观看| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲国产精品专区欧美| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产视频首页在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品亚洲一区二区| av国产久精品久网站免费入址| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 色视频在线一区二区三区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| av在线播放精品| 精品亚洲成国产av| 日本与韩国留学比较| av国产久精品久网站免费入址| 日韩一区二区视频免费看| 91国产中文字幕| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 日日撸夜夜添| 婷婷成人精品国产| 亚洲av欧美aⅴ国产| 视频中文字幕在线观看| av专区在线播放| 国产一区二区在线观看日韩| 成年人午夜在线观看视频| 午夜福利,免费看| 日日撸夜夜添| 欧美成人精品欧美一级黄| 天堂中文最新版在线下载| 青青草视频在线视频观看| av黄色大香蕉| 午夜av观看不卡| 午夜福利影视在线免费观看| 国产午夜精品一二区理论片| 最近最新中文字幕免费大全7| 久久久久国产精品人妻一区二区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 永久免费av网站大全| 国产成人av激情在线播放 | 五月伊人婷婷丁香| 亚洲人与动物交配视频| 看免费成人av毛片| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产成人精品无人区| 午夜免费鲁丝| 国产又色又爽无遮挡免| 各种免费的搞黄视频| 韩国高清视频一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| 观看美女的网站| 丝袜喷水一区| 草草在线视频免费看| 黄色视频在线播放观看不卡| 九九在线视频观看精品| 久久青草综合色| 天天影视国产精品| 搡女人真爽免费视频火全软件| 久久精品夜色国产| av.在线天堂| 久久精品久久精品一区二区三区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 97超视频在线观看视频| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩av在线免费看完整版不卡| 久久韩国三级中文字幕| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人国语在线视频| 91精品国产九色| 最近中文字幕2019免费版| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美日韩在线观看h| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产在线视频一区二区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久久久久国产电影| 国产精品国产三级专区第一集| 99九九在线精品视频| 91精品一卡2卡3卡4卡| 99久久中文字幕三级久久日本| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本-黄色视频高清免费观看| 视频中文字幕在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一本色道久久久久久精品综合| 妹子高潮喷水视频| 男女边摸边吃奶| 亚洲精品国产av成人精品| 国产一区二区三区综合在线观看 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品国产av在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品久久久久久久久免| 最新的欧美精品一区二区| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 麻豆乱淫一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 在线观看免费高清a一片| 赤兔流量卡办理| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 2021少妇久久久久久久久久久| 少妇高潮的动态图| 多毛熟女@视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 日韩伦理黄色片| 在线免费观看不下载黄p国产| 日本免费在线观看一区| 大片免费播放器 马上看| 中国美白少妇内射xxxbb| xxx大片免费视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久免费观看电影| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产av码专区亚洲av| 一级二级三级毛片免费看| 久久久a久久爽久久v久久| 少妇丰满av| 国产69精品久久久久777片| 久久热精品热| 国产片特级美女逼逼视频| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 观看美女的网站| 国产精品国产av在线观看| 亚洲av福利一区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产黄片视频在线免费观看| 久热这里只有精品99| 十分钟在线观看高清视频www| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日本与韩国留学比较| 51国产日韩欧美| 亚洲第一区二区三区不卡| 好男人视频免费观看在线| 亚洲在久久综合| 国产精品一区二区在线不卡| 18+在线观看网站| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品成人在线| 另类精品久久| 国产黄频视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 亚洲精品自拍成人| 欧美xxxx性猛交bbbb| 高清黄色对白视频在线免费看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 黄片播放在线免费| 欧美+日韩+精品| 97在线视频观看| 国产成人精品一,二区| 亚洲综合色惰| 日本91视频免费播放| 成人国产麻豆网| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产熟女午夜一区二区三区 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 婷婷成人精品国产| 日本午夜av视频| 国产精品国产三级国产专区5o| a级毛片在线看网站| a级毛片黄视频| 日本免费在线观看一区| 国内精品宾馆在线| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品久久久精品久久久| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 看十八女毛片水多多多| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲国产日韩一区二区| 国产黄片视频在线免费观看| 大香蕉久久网| 好男人视频免费观看在线| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产成人免费观看mmmm| 三级国产精品片| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成人av在线免费| 一二三四中文在线观看免费高清| 黄色一级大片看看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| www.av在线官网国产| 日韩成人av中文字幕在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久青草综合色| 国产一区二区三区综合在线观看 | 亚洲人成网站在线播| 男人操女人黄网站| 特大巨黑吊av在线直播| 人人妻人人澡人人看| 自线自在国产av| 精品国产一区二区久久| 国产在线一区二区三区精| 少妇丰满av| 国产爽快片一区二区三区| 美女主播在线视频| av线在线观看网站| 日日撸夜夜添| 黄色欧美视频在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 99久久精品一区二区三区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 日韩视频在线欧美| 欧美另类一区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 在线观看国产h片| 免费看不卡的av| 国产精品一区二区在线不卡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久青草综合色| 少妇高潮的动态图| 人妻人人澡人人爽人人| 国产免费一级a男人的天堂| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 男人爽女人下面视频在线观看| 91久久精品电影网| 免费黄色在线免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 三上悠亚av全集在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 丝瓜视频免费看黄片| 国产成人91sexporn| 国产乱人偷精品视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 精品亚洲成a人片在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩中文字幕视频在线看片| 两个人免费观看高清视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 色5月婷婷丁香| 综合色丁香网| 国产成人精品在线电影| 最近手机中文字幕大全| 成人毛片60女人毛片免费| 九色亚洲精品在线播放| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产精品一二三区在线看| 日本色播在线视频| 97在线人人人人妻| 成人国语在线视频| 人妻 亚洲 视频| 国产亚洲最大av| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产 精品1| 午夜日本视频在线| 999精品在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 精品国产一区二区久久| 国产日韩欧美在线精品| 中文字幕最新亚洲高清| 国产在线免费精品| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产 精品1| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久久久久大尺度免费视频| 日本wwww免费看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 51国产日韩欧美| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产淫语在线视频| 青青草视频在线视频观看| 五月开心婷婷网| 午夜91福利影院| 永久免费av网站大全| 日韩一区二区三区影片| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品欧美亚洲77777| 伦精品一区二区三区| 毛片一级片免费看久久久久| 天天影视国产精品| 夫妻午夜视频| 亚洲国产日韩一区二区| 成人无遮挡网站| 永久网站在线| 少妇熟女欧美另类| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日本91视频免费播放| 高清av免费在线| 尾随美女入室| 99九九在线精品视频| 两个人的视频大全免费| 亚洲成人一二三区av| 国产伦精品一区二区三区视频9| 天天影视国产精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 91久久精品电影网| 飞空精品影院首页| 日韩中文字幕视频在线看片| 尾随美女入室| 能在线免费看毛片的网站| 母亲3免费完整高清在线观看 | 日本av手机在线免费观看| 老司机影院毛片| 下体分泌物呈黄色| 日本av免费视频播放| 97在线人人人人妻| 精品一区在线观看国产| videosex国产| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲熟女精品中文字幕| 少妇精品久久久久久久| 男女国产视频网站| 黄色配什么色好看| 大香蕉97超碰在线| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品,欧美精品| 成年av动漫网址| 97超视频在线观看视频| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲成人手机| 中文天堂在线官网| 中文字幕亚洲精品专区| 一级毛片 在线播放| av专区在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 日本免费在线观看一区| 韩国高清视频一区二区三区| 久久久久久久久大av| 少妇的逼水好多| 国产av国产精品国产| 国产精品久久久久久久电影| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 草草在线视频免费看| 久久这里有精品视频免费| 久久97久久精品| 在线看a的网站| 久久精品久久久久久久性| av免费在线看不卡| 亚洲无线观看免费| 日日爽夜夜爽网站| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 人妻系列 视频| 少妇人妻 视频| 在线观看人妻少妇| 久久综合国产亚洲精品| 熟女av电影| 一本久久精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美国产精品一级二级三级| 久久久久久久久久久免费av| 简卡轻食公司| 国产一区二区在线观看日韩| 国产色婷婷99| 中文字幕最新亚洲高清| 插逼视频在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲国产精品专区欧美| 国产伦理片在线播放av一区| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 一级二级三级毛片免费看| 99国产综合亚洲精品| 99热6这里只有精品| 亚洲美女视频黄频| 免费看不卡的av| 能在线免费看毛片的网站| 视频在线观看一区二区三区| 丝瓜视频免费看黄片| 精品一区在线观看国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美日韩av久久| 亚洲av成人精品一二三区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 性色avwww在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 91成人精品电影| 观看美女的网站| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产精品欧美亚洲77777| 夫妻性生交免费视频一级片| 少妇人妻精品综合一区二区| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产av一区二区精品久久| av国产久精品久网站免费入址| 免费高清在线观看视频在线观看| 少妇精品久久久久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产永久视频网站| 99热这里只有精品一区| 大码成人一级视频| 欧美日本中文国产一区发布| 国产成人aa在线观看| 少妇人妻 视频| 在线播放无遮挡| 插阴视频在线观看视频| 大香蕉久久成人网| 久久久国产欧美日韩av| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 欧美成人午夜免费资源| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 18禁在线无遮挡免费观看视频| 超色免费av| 国产在线一区二区三区精| 久久久久人妻精品一区果冻| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| .国产精品久久| 日本黄色片子视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲成色77777| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产成人精品婷婷| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产69精品久久久久777片| 久久久国产一区二区| 成人免费观看视频高清| 熟女人妻精品中文字幕| 我的女老师完整版在线观看| 日韩成人伦理影院| 日本欧美国产在线视频| 久久精品国产自在天天线| 97超碰精品成人国产| 免费日韩欧美在线观看| 草草在线视频免费看| 亚洲,欧美,日韩| 国产老妇伦熟女老妇高清| 草草在线视频免费看| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩亚洲欧美综合| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| av卡一久久| 这个男人来自地球电影免费观看 | 男女国产视频网站| 永久网站在线|