碳源和氮源對5-酮基-葡萄糖酸生成的影響

譚之磊，王洪翠，魏彧翹，李艷艷，鐘成，賈士儒

天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457

L(+)-酒石酸是一種天然有機(jī)酸，其他旋光性酒石酸在自然界尚未被發(fā)現(xiàn)[1]，其鹽類較穩(wěn)定，應(yīng)用廣泛。在食品和飲料中可用作食品添加劑，如酸味劑和膨化劑，酸味值約為檸檬酸的1.3倍，而且是葡萄酒生產(chǎn)過程中唯一一種允許添加的酸味劑[2]，對葡萄酒的味道及口感有很重要的影響[3]；在醫(yī)藥方面，可作外科繃帶硬化劑、藥物拆分劑和酒石酸異丁嗪等藥品的成鹽劑[4]；在紡織工業(yè)上，用作酸性還原劑[5]。此外，還可作印染的防染劑、照相顯影劑[6]以及應(yīng)用于電鍍、制革[7]等行業(yè)。酒石酸的生產(chǎn)方法主要有提取法[8]、半生物合成法[9-10]和酶法[11]，目前國內(nèi)生產(chǎn)L(+)-酒石酸主要是采用酶法，利用微生物轉(zhuǎn)化順式環(huán)氧琥珀酸[11]的方法，能產(chǎn)生順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的菌種[12-13]有很多，其常用生產(chǎn)菌種主要是棒狀桿菌[14]和諾卡氏菌[15]，此工藝的底物為順式環(huán)氧琥珀酸，其來源復(fù)雜[16]，安全性低，耗能高。氧化葡萄糖桿菌[17]Gluconobacter oxydans可以將葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并進(jìn)一步氧化成 2-酮基-葡萄糖酸(2KGA)和 5-酮基-葡萄糖酸[9](5KGA)，其中5KGA在催化劑[10]的作用下能夠轉(zhuǎn)化為L(+)-酒石酸[18]，此方法改善了以上不足之處。Helmut G?risch 等[19-20]篩選出一株核黃素依賴型GA-2-DH酶活缺失型突變株 Gluconobacter oxydans MF1，此突變株不生成2KGA，使5KGA的轉(zhuǎn)化率達(dá)到84%。文中以不生成2KGA的氧化葡萄糖桿菌Gluconobacter oxydans HGI-1為生產(chǎn)菌株，研究不同碳源和氮源對5KGA生成的影響。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

氧化葡萄糖桿菌 Gluconobacter oxydans HGI-1由日本玉川大學(xué)Tatsuo Hoshino教授贈送。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：甘露醇 25，酵母浸粉 5，蛋白胨 3。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 100，玉米粉3，酵母浸粉 1.67，NH4Cl 1.50，KH2PO40.10，MgSO4·5H2O 0.25，MnSO4·5H2O 0.03，CaCO330。

發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 100，玉米粉3，酵母浸粉 1.67，NH4Cl 1.50， KH2PO40.10，MgSO4·5H2O 0.25， MnSO4·5H2O 0.03，CaCO30.34。

1.2 培養(yǎng)和檢測方法

1.2.1 種子液制備

從斜面上挑取兩環(huán)菌種于液體種子培養(yǎng)基中，搖床 (30 ℃，180 r/min)培養(yǎng)20 h。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

500 mL三角瓶裝液量為 50 mL，接種量為10%，搖床 (30 ℃，180 r/min)培養(yǎng)72 h。

1.2.3 5 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

采用5 L全自動發(fā)酵罐 (BLBIO-XGJG,上海百侖生物科技有限公司)，培養(yǎng)基裝液量為3 L，接種量為10%(V/V)，在發(fā)酵過程中，控制溫度為30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為750 r/min，通氣速率為1 vvm，自動流加6 mol/L KOH控制發(fā)酵過程中的pH在5.50，葡萄糖濃度降至0 g/L時，不再控制pH。發(fā)酵過程由發(fā)酵罐控制系統(tǒng)軟件進(jìn)行在線控制和數(shù)據(jù)采集。

1.2.4 5-酮基-D-葡萄糖酸的測定

采用高效液相色譜儀(型號：1100，安捷倫(中國)有限公司)測定5-酮基-D-葡萄糖酸的含量。具體條件：反相色譜柱 Themos BDS C18(4.6 mm ID×250 mm)，流動相為 10 mmol/L HClO4[21]，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對5KGA生產(chǎn)的影響

2.1.1 碳源種類對5KGA產(chǎn)量的影響

分別以初始濃度為100 g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉作碳源，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖1可知，當(dāng)碳源分別為乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和葡萄糖時，5KGA的產(chǎn)量分別為16.50、11.90、25.00、45.60和98.20 g/L，其中葡萄糖為碳源時5KGA產(chǎn)量最高，這可能是由于蔗糖、麥芽糖、乳糖為二糖，可溶性淀粉為多糖，不易被菌體利用，菌體利用上述碳源時，需先將其水解為單糖，才能被菌體利用生成5KGA。而葡萄糖能直接被菌體利用，更有利于5KGA的生成，因此選用葡萄糖作碳源。

圖1 不同碳源對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effects of different carbon sources on the 5-keto-gluconic acid production.

2.1.2 葡萄糖濃度對5KGA產(chǎn)量的影響

選擇葡萄糖初始濃度分別為 60、80、100、120和140 g/L，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖2可知，當(dāng)葡萄糖濃度在60–100 g/L時，5KGA的產(chǎn)量隨葡萄糖濃度的增大而增大，100 g/L時最高為 98.21 g/L，而當(dāng)葡萄糖濃度再增大時 5KGA的產(chǎn)量反而下降，這說明較低或較高的葡萄糖濃度皆不適宜5KGA的生成，這可能是由于高濃度的葡萄糖抑制了菌體的生長[22]，從而影響了5KGA的生成。

圖2 不同葡萄糖濃度對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 2 Effects of different glucose concentrations on the 5-keto-gluconic acid production.

2.2 有機(jī)氮源對5KGA生產(chǎn)的影響

2.2.1 有機(jī)氮源種類對5KGA產(chǎn)量的影響

以魚粉、玉米漿、黃豆餅粉和棉籽餅粉為氮源，其蛋白含量分別為55%、40%、38%和40%，按蛋白終含量為1.20%分別添加2.20、3.00、3.15和3.00 g，以酵母粉為(蛋白含量為 68%)對照，其添加量為1.67 g/L，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖3可知，當(dāng)使用酵母粉作氮源時，5KGA產(chǎn)量為98.21 g/L。當(dāng)使用魚粉、玉米漿、黃豆餅粉、棉籽餅作有機(jī)氮源時，5KGA產(chǎn)量分別為101.40、79.20、70.10和62.10 g/L。魚粉和玉米漿作氮源產(chǎn)量較黃豆餅粉、棉籽餅高。魚粉作氮源時產(chǎn)量超過酵母粉作氮源時的產(chǎn)量，雖然差異未達(dá)到顯著性水平(數(shù)據(jù)未列出)，但考慮到魚粉和玉米漿的價格優(yōu)勢，有望作為工業(yè)化生產(chǎn)氮源。

2.2.2 魚粉、玉米漿起始濃度對5KGA產(chǎn)量的影響

圖3 不同氮源對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 3 Effects of different nitrogen sources on the 5-keto-gluconic acid production.

分別添加魚粉(1.50/2.20/3 g)、玉米漿(2/3/4 g)作為氮源，其最終蛋白含量分別為0.80%、1.20%和1.60%，三角瓶振蕩培養(yǎng)72 h。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基中蛋白含量為1.60%時，魚粉作有機(jī)氮源，5KGA產(chǎn)量最高為109.10 g/L，其次是使用玉米漿時，5KGA產(chǎn)量最高為93.80 g/L?？紤]到玉米漿作氮源與魚粉作氮源5KGA產(chǎn)量接近，但價格僅為魚粉的40%左右，文中選擇了玉米漿為氮源，進(jìn)一步做了5 L發(fā)酵罐放大研究。

2.3 5 L自動發(fā)酵罐分批發(fā)酵

5 L自動發(fā)酵罐分批發(fā)酵過程中，葡萄糖濃度降至0 g/L之前，自動流加6 mol/L KOH控制發(fā)酵過程中的pH在5.50，葡萄糖濃度降至0 g/L后，不再控制 pH。這是由于 1991年 Qazi等[23]發(fā)現(xiàn)pH為5.50 最利于G. oxydans的細(xì)胞生長，且是葡萄糖脫氫酶的最適 pH。5KGA生成過程可分為兩個階段，即先將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，葡糖酸再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成 5KGA[20]，葡萄糖氧化生成葡萄糖酸后，pH下降，葡萄糖濃度降為0 g/L，pH不再降低。在第一階段中，為了保證菌體最大限度地利用葡萄糖并將其氧化成葡萄糖酸，控制 pH為5.50，這有利于細(xì)胞生長和葡萄糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖酸[24]。

圖4 不同蛋白濃度魚粉、玉米漿對5KGA產(chǎn)量的影響Fig. 4 Effects of different protein concentrations of fish meal and corn steep liquor on the 5-keto-gluconic acid production.

由圖5(A)和圖6(A)可知，以酵母粉作有機(jī)氮源時，發(fā)酵9 h葡萄糖的濃度降至0 g/L、5KGA開始生成，10.5 h時生成速率最大、達(dá)到8.60 g/(L·h)，72 h時5KGA產(chǎn)量達(dá)到最大、為105.41 g/L，轉(zhuǎn)化率為90.60%，平均生成速率為 1.44 g/(L·h)。由圖 5B 和 6B 可知，以玉米漿作有機(jī)氮源，18 h時5KGA開始生成，5KGA 生成速率在 26 h時達(dá)最大，為3.48 g/(L·h)，60 h時5KGA產(chǎn)量達(dá)到最大，為93.80 g/L。平均生成速率為1.56 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為85.93%。

圖5 以酵母粉(A)和玉米漿(B)作氮源分批發(fā)酵生產(chǎn)5KGAFig. 5 Time course of batch 5KGA production with yeast extract (A)and corn steep (B)liquor as nitrogen source.

圖6 以酵母粉(A)和玉米漿(B)作氮源5KGA生成速率曲線Fig. 6 Time course of 5KGA specific production rate with yeast extract (A)and corn steep (B)liquor as nitrogen source.

以玉米漿作有機(jī)氮源 5KGA的產(chǎn)量與酵母粉作有機(jī)氮源接近，玉米漿成本遠(yuǎn)低于酵母粉，同時發(fā)酵周期縮短，平均生成速率為1.56 g/(L·h)高于以酵母粉作有機(jī)氮源的平均生成速率1.44 g/(L·h)。

3 討論

三角瓶和5 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵放大試驗(yàn)結(jié)果表明：采用菌株Gluconobacter oxydans HGI-1生產(chǎn) 5KGA，最佳碳源為葡萄糖，最佳濃度為100 g/L。最佳氮源為酵母粉，其次為魚粉、玉米漿?？紤]工業(yè)生產(chǎn)成本問題，選擇玉米漿作為有機(jī)氮源，其最佳添加量為 4 g/L。以葡萄糖為碳源、玉米漿為有機(jī)氮源 5KGA 的發(fā)酵水平達(dá)到了93.80 g/L，平均生成速率為1.56 g/(L·h)，轉(zhuǎn)化率為85.93%，發(fā)酵周期較酵母粉縮短15 h，5KGA平均生成速率提高 8.26%，取得了較好的實(shí)驗(yàn)效果。

Hirohide TOYAMA等[25]研究了以葡萄糖為唯一碳源，在葡萄糖濃度為20 g/L (111 mmol/L)、不控制pH條件下，G. suboxydans IFO 12528生成5KGA的產(chǎn)量為12.61 g/L，轉(zhuǎn)化率僅為59%。Helmut G?risch等[19]篩選出一株核黃素依賴型GA-2-DH酶活缺失型突變株 Gluconobacter oxydans MF1，使用酵母粉作有機(jī)氮源，葡萄糖濃度為25 g/L時，5KGA的產(chǎn)量為22.70 g/L，其葡萄糖轉(zhuǎn)化率為84%。與其相比，Gluconobacter oxydans HGI-1以葡萄糖為碳源、玉米漿為有機(jī)氮源生產(chǎn)5KGA轉(zhuǎn)化率與文獻(xiàn)水平相當(dāng)，但以玉米漿作氮源降低了生產(chǎn)成本，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

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