7-脫氫膽甾醇合成功能模塊與底盤細(xì)胞的適配性

張瑩，張璐，劉奪，丁明珠，周曉，元英進(jìn)

天津大學(xué)化工學(xué)院 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300072

膽甾相液晶材料在顯示、電磁場檢測、生物醫(yī)學(xué)等方面均有著廣泛的應(yīng)用。作為膽甾相液晶材料的重要前體物，7-脫氫膽甾醇 (7-DHC)需求量巨大，但其來源和產(chǎn)量問題無法滿足當(dāng)前日益增長的需求[1]?，F(xiàn)有的7-DHC生產(chǎn)方法主要是化學(xué)全合成，但其工藝流程長、收率低、能耗高、副產(chǎn)物去除過程復(fù)雜，且易對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染[2-3]。已有研究者實(shí)現(xiàn)了利用酶促轉(zhuǎn)化合成7-DHC，雖然反應(yīng)溫和，但底物與酶的成本問題成為限制該技術(shù)工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸[4]。

合成生物技術(shù)在合成重要產(chǎn)品、生產(chǎn)清潔能源、維護(hù)人類健康等方面均取得了令人矚目的成果，引起極大關(guān)注[5]。利用合成生物技術(shù)構(gòu)建7-DHC人工細(xì)胞可以彌補(bǔ)化學(xué)法和酶促法的不足，且生產(chǎn)過程綠色清潔，具有很大的優(yōu)勢和廣闊的市場前景。目前國內(nèi)并無利用合成生物技術(shù)生產(chǎn) 7-DHC的報(bào)道，國際上也多以7-DHC為中間產(chǎn)物，進(jìn)一步合成雄烯二酮等甾體激素類藥物，鮮有以7-DHC為目標(biāo)產(chǎn)物的相關(guān)文獻(xiàn)。Christine和 Markus于2006年公開了酵母中生產(chǎn)7-DHC的方法。通過表達(dá)來自小鼠和人的C-8甾醇異構(gòu)酶、C-5甾醇去飽和酶和甾醇C24-還原酶的基因，并將ERG5和ERG6失活且 tHMG1基因被過表達(dá)，獲得了能合成7-DHC的酵母菌[6]。荷蘭的Hohmann Hans-Peter等也通過上調(diào) HMG1的截短基因，失活 ERG5和 ERG6，并引入脊椎動(dòng)物來源的甾醇 C24-還原酶，實(shí)現(xiàn)了在酵母中生產(chǎn)7-DHC[7]。

釀酒酵母中存在固醇類物質(zhì)的合成途徑。作為單細(xì)胞真核生物，釀酒酵母不僅擁有轉(zhuǎn)錄后修飾功能，基因工程操作簡單，便于培養(yǎng)和大規(guī)模發(fā)酵；且遺傳背景較清晰，次生代謝產(chǎn)物較單一，能簡化代謝工程產(chǎn)物的純化[8]。因此釀酒酵母是理想的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，適合作為固醇類物質(zhì)人工合成的底盤細(xì)胞。通過對功能模塊內(nèi)啟動(dòng)子、質(zhì)粒等指標(biāo)的改變，調(diào)節(jié)模塊與底盤細(xì)胞的適配性，從而增加目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，是合成生物技術(shù)發(fā)展中的關(guān)鍵問題[9-10]。以釀酒酵母為底盤細(xì)胞生產(chǎn)7-DHC，國外以基因工程手段為主，并沒有對合成功能模塊與底盤細(xì)胞的適配關(guān)系進(jìn)行研究。因此，以合成生物學(xué)為基礎(chǔ)，注重挖掘功能模塊與底盤細(xì)胞間的適配關(guān)系，降低酵母底盤細(xì)胞的代謝壓力，提高與功能模塊的適配性，從而增強(qiáng)人工合成細(xì)胞的魯棒性，具有很大的研究價(jià)值。

7-DHC 在酵母中的生物合成過程見圖 1[7,11-12]，是以酵母固醇為底物，引入 C-24還原酶將側(cè)鏈C-24位雙鍵還原，并與內(nèi)源基因ERG2編碼的C-8異構(gòu)酶、ERG3編碼的C-5脫氫酶共同實(shí)現(xiàn)。本研究利用合成生物技術(shù)，敲除非必需基因固醇 C-24甲基轉(zhuǎn)移酶基因(ERG6)、固醇 C-22脫氫酶基因 (ERG5)以抑制主要競爭路徑中麥角固醇的合成[13-15]，減少酵母固醇向麥角固醇的轉(zhuǎn)化，增加底物的積累；過表達(dá)截短的HMG-CoA還原酶基因 (tHMGR)[16-17]、角鯊烯環(huán)氧酶基因 (ERG1)[18-19]等基因元件，提高酵母固醇合成途徑中限速步驟的酶表達(dá)，以調(diào)節(jié)內(nèi)源功能模塊與底盤細(xì)胞的適配性，優(yōu)化前體酵母固醇的供給代謝；同時(shí)引入人源 C-24還原酶基因 (DHCR24)[20-22]設(shè)計(jì)并構(gòu)建7-DHC合成外源功能模塊。通過對模塊內(nèi)不同強(qiáng)度啟動(dòng)子、不同底盤細(xì)胞等參數(shù)的考察，從異源基因表達(dá)的密碼子優(yōu)化、合成途徑的標(biāo)準(zhǔn)化組裝、合成途徑的精細(xì)調(diào)控等方面研究外源功能模塊與釀酒酵母底盤細(xì)胞的適配關(guān)系，得到穩(wěn)定高產(chǎn)7-DHC的人工細(xì)胞。整體研究思路見圖2。

圖1 7-脫氫膽甾醇在酵母中的生物合成路徑[7,11-12]Fig. 1 7-DHC biosynthetic pathway in Saccharomyces cerevisiae[7,11-12].

圖2 本研究的整體思路Fig.2 Research purpose in this study.

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基

大腸桿菌Escherichia coli BMDH5α購于博邁德公司。釀酒酵母 Saccharomyces cerevisiae YSG50由美國伊利諾伊大學(xué)香檳分校趙惠民教授饋贈(zèng)[23]，W303a、BY4742、YML 和SyBE_001344、SyBE_001358均由本實(shí)驗(yàn)室保存。本研究所用酵母細(xì)胞見表1。

本研究所用質(zhì)粒包括大腸桿菌質(zhì)粒pSB1A2、pUC18，酵母整合型質(zhì)粒pRS403，酵母復(fù)制型質(zhì)粒pRS425和pYES2均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

大腸桿菌BMDH5α的保存和培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基 (10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl；固體培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉)，篩選大腸桿菌轉(zhuǎn)化子用含有 100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基。酵母菌保存和培養(yǎng)用YPD培養(yǎng)基 (10 g/L酵母提取物，20 g/L細(xì)菌蛋白胨，20 g/L葡萄糖；固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉)，酵母重組菌株篩選用 SC drop-out培養(yǎng)基(6.7 g/L酵母氮源，2 g/L drop-out氨基酸混合物，20 g/L葡萄糖；固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂粉)。

表1 本研究所用酵母細(xì)胞Table 1 Yeast cells used in this study

1.2 工具酶和試劑

本研究所用限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、高保真Fast Pfu DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶均購自 Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒提取試劑盒、酵母質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根公司；醋酸鋰購自天津蘇莊化學(xué)試劑廠；酵母氮源、PEG4000購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨、酵母提取物購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、NaCl、KOH購自北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；瓊脂粉購自天津英博生化試劑有限公司；甲醇購自康科德公司；正己烷購自天津大茂化學(xué)試劑廠；7-脫氫膽甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、衍生化試劑MSTFA、吡啶購自Sigma公司。

1.3 基因元件的引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增與合成

為實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化組裝，采用biobrick同尾酶的方法構(gòu)建質(zhì)粒[24]。對內(nèi)源基因tHMGR、啟動(dòng)子TDH3p、終止子 PGK1t進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，5′端分別引入 EcoRⅠ、XbaⅠ兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，3'端分別引入PstⅠ、SpeⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。內(nèi)源基因 ERG1、啟動(dòng)子 PGK1p、終止子 PGK1t的引物設(shè)計(jì)，5′端分別引入 SacⅠ、XhoⅠ兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，3′端分別引入BamHⅠ、SalⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)。使用酵母選擇標(biāo)記LEU實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因ERG5的敲除，根據(jù)GenBank中釀酒酵母ERG5上下游的基因序列設(shè)計(jì)引物，選擇標(biāo)記LEU 的 5′端、3′端分別引入 34 bp、38 bp的同源臂。內(nèi)源基因、啟動(dòng)子、終止子均以 GenBank中釀酒酵母 S288c的基因組為模板，進(jìn)行高保真的PCR擴(kuò)增。選擇標(biāo)記以含有該標(biāo)記的酵母質(zhì)粒pRS425為模板，進(jìn)行高保真的PCR擴(kuò)增。本研究所用引物見表2。

選擇人體來源的C-24還原酶 (DHCR24)，在GenBank中查找相應(yīng)氨基酸序列，根據(jù)底盤酵母偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化后的核苷酸序列與終止子PGK1t的核苷酸序列相連，并在5′端分別引入 EcoRⅠ、XbaⅠ兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)，3′端分別引入 PstⅠ、SpeⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，全合成該基因。合成的基因片段通過HindⅢ、BsrGⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，連接于穿梭載體pYES2上。

1.4 功能模塊的構(gòu)建

EcoRⅠ、PstⅠ酶切PCR產(chǎn)物PGK1t，并與相同酶切的質(zhì)粒 pSB1A2連接，構(gòu)建質(zhì)粒pSB1A2-PGK1t后，使用EcoRⅠ、XbaⅠ酶切該質(zhì)粒。EcoRⅠ、SpeⅠ酶切PCR產(chǎn)物tHMGR，與酶切后的質(zhì)粒 pSB1A2-PGK1t連接，構(gòu)建質(zhì)粒pSB1A2-tHMGR-PGK1t。再次EcoRⅠ、SpeⅠ酶切 PCR產(chǎn)物 TDH3p，與使用 EcoRⅠ、XbaⅠ酶切的質(zhì)粒pSB1A2-tHMGR-PGK1t連接，構(gòu)建質(zhì)粒pSB1A2-TDH3p-tHMGR-PGK1t。EcoRⅠ、SpeⅠ酶切該質(zhì)粒，得到TDH3p-tHMGR- PGK1t片段，與相同酶切的質(zhì)粒pRS403連接，構(gòu)建功能模塊pRS403-TDH3p-tHMGR-PGK1t，命名為SyBE_000916。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

SacⅠ、SalⅠ酶切 PCR產(chǎn)物 PGK1t，并與相同酶切的質(zhì)粒 pUC18連接，構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-PGK1t后，使用SacⅠ和XhoⅠ酶切該質(zhì)粒。SacⅠ和 SalⅠ酶切 PCR產(chǎn)物 ERG1，并與酶切后的質(zhì)粒 pUC18-PGK1t連接，構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-ERG1-PGK1t。再次 SacⅠ、SalⅠ酶切PCR產(chǎn)物PGK1p，與使用SacⅠ、XhoⅠ酶切的質(zhì)粒 pUC18-ERG1-PGK1t連接，構(gòu)建質(zhì)粒pUC18-PGK1p-ERG1-PGK1t。XhoⅠ、Hind III酶切該質(zhì)粒，得到PGK1p-ERG1-PGK1t片段，并與相同酶切的質(zhì)粒 pRS425連接，構(gòu)建質(zhì)粒pRS425-PGK1p-ERG1-PGK1t。ApaⅠ、SalⅠ酶切該質(zhì)粒，得到PGK1p-ERG1-PGK1t片段，并與ApaⅠ、XhoⅠ酶切后的質(zhì)粒pRS403-TDH3ptHMGR-PGK1t連接，得到內(nèi)源功能模塊pRS403-PGK1p-ERG1-PGK1t-TDH3p-tHMGRPGK1t，命名為SyBE_000923。

EcoRⅠ、SpeⅠ酶切 PCR產(chǎn)物 TDH3p，與使用 EcoRⅠ、XbaⅠ酶切的質(zhì)粒 pYES2-DHCR24-PGK1t連接，構(gòu)建外源功能模塊pYES2-TDH3p-DHCR24-PGK1t，命名為SyBE_000937。同理，啟動(dòng)子可替換為PGK1p、TDH1p，得到包含不同啟動(dòng)子的外源功能模塊分別命名為SyBE_000938、SyBE_000939。本研究構(gòu)建的功能模塊見表3。

1.5 DNA操作

大腸桿菌的轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)[25]進(jìn)行。構(gòu)建的功能模塊通過 LiAc法[26]導(dǎo)入不同的底盤酵母細(xì)胞內(nèi)，利用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組，通過PCR檢測目的片段的存在，從而確定陽性克隆。

1.6 產(chǎn)物提取方法

將篩選出的陽性克隆接種到種子培養(yǎng)基中，30 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)，待種子培養(yǎng)至第3代時(shí)轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使發(fā)酵初始OD600為0.2。30 ℃培養(yǎng)72 h后取出發(fā)酵液，1 000 r/min離心2 min，棄上清液留下層沉淀，反復(fù)水洗2次后收集細(xì)胞，用液氮冷凍并研磨；稱取200 mg研磨后細(xì)胞加入甲醇配制的1.5 mol/L KOH，在85 ℃恒溫水槽中進(jìn)行皂化反應(yīng)90 min；然后加入1 mL正己烷，漩渦振蕩混合均勻，1 000 r/min離心5 min，取上清液真空冷凍干燥，–40 ℃下保存在 1 mL離心管中備用。向離心管中加入50 μL 吡啶，80 μL N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺 (MSTFA)，在30 ℃恒溫水槽中進(jìn)行衍生化反應(yīng)30 min[27]。

表3 本研究所構(gòu)建的功能模塊Table 3 Functional modules constructed in this study

1.7 GC-TOF/MS檢測

對提取的產(chǎn)物進(jìn)行氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF/MS)分析檢測。分析條件如下：儀器為 Waters公司的 GC-TOF/MS (Waters Corp.，USA)；硅膠毛細(xì)管柱為 30 m×0.25 mm×0.25 μm DB-5MS，J&W Scientific，F(xiàn)olsom。電離方式為電子轟擊電離EI+，電子束能量70 eV，離子化電流40 μA。質(zhì)譜掃描范圍在50～800 m/z，離子源溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，氦氣(99.999 5%)用作載氣，91 kPa恒壓模式下操作。柱溫在70 ℃保持 2 min，以30 ℃/min的速度升至 250 ℃，然后以 10 ℃/min的速度升到280 ℃，在280 ℃維持15 min；再以5 ℃/min的速度升到290 ℃，在290 ℃維持5 min。

2 結(jié)果與分析

本研究對表 1所列酵母細(xì)胞進(jìn)行改造，得到改造后底盤細(xì)胞 SyBE_000954 (YML，erg5::LEU2)；引入內(nèi)源功能模塊SyBE_000916、SyBE_000923以調(diào)節(jié)模塊與底盤的適配性，獲得酵母細(xì)胞SyBE_000955 ( SyBE_000954，HIS::SyBE_000916)和 SyBE_000956 (SyBE_000954，HIS:: SyBE_000923)。在此基礎(chǔ)上引入人源C-24還原酶構(gòu)建外源功能模塊，得到9株7-DHC人工合成細(xì)胞，如表4所示。

2.1 主要競爭途徑麥角固醇合成的抑制

在釀酒酵母的代謝中，麥角固醇的生物合成是主要途徑。因此為了提高底物酵母固醇濃度，需抑制酵母固醇向麥角固醇的轉(zhuǎn)化。以釀酒酵母ERG6單敲菌YML為酵母細(xì)胞，采用同源重組實(shí)現(xiàn)內(nèi)源基因 ERG5的敲除，獲得麥角固醇合成途徑中的底盤細(xì)胞。通過PCR擴(kuò)增將ERG5基因序列前后的同源臂引入酵母選擇標(biāo)記LEU，PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化底盤細(xì)胞YML，利用營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)在 SC drop-out培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組。以LEU的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢驗(yàn)選擇標(biāo)記LEU的存在，從而確定陽性克隆。改造后的底盤細(xì)胞命名為SyBE_000954。

對原始菌株 BY4742和改造后底盤細(xì)胞SyBE_000954的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行 GC-TOF/MS檢測。各發(fā)酵產(chǎn)物對比見圖 3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SyBE_000954的麥角固醇 (Egosterol)含量低于 BY4742，而酵母固醇 (Zymosterol)的含量在 SyBE_000954中明顯高于 BY4742。這說明內(nèi)源基因ERG6編碼的固醇C-24甲基轉(zhuǎn)移酶、ERG5編碼的固醇C-22脫氫酶催化的反應(yīng)是麥角固醇生物合成途徑中的重要限速步驟[14]，對它們的敲除可以有效抑制麥角固醇的合成，增加7-DHC的合成底物酵母固醇的積累。

表4 本研究所構(gòu)建的人工合成細(xì)胞Table 4 Artificial synthetic cell obtained in this study

圖3 不同酵母細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)物的對比Fig.3 Comparison of product in different yeast cells.

2.2 內(nèi)源功能模塊與底盤細(xì)胞的適配關(guān)系

研究表明，HMGR是酵母甲羥戊酸途徑中的第一個(gè)限速酶，是固醇類物質(zhì)代謝中的重要調(diào)控靶點(diǎn)[28]。HMGR在麥角固醇含量高時(shí)會(huì)受到反饋抑制，過表達(dá)截短的HMGR (tHMGR)可以解除途徑中的反饋抑制[29]，雖能大量積累前體物鯊烯，卻對后續(xù)固醇類的產(chǎn)量無較大影響。因此，本工作以鯊烯為節(jié)點(diǎn)，將底物酵母固醇合成路徑分為上游和下游兩部分，研究內(nèi)源功能模塊與底盤細(xì)胞的適配性。

2.2.1 上游路徑的優(yōu)化

以功能模塊 SyBE_000916轉(zhuǎn)化底盤細(xì)胞SyBE_000954，利用營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)在SC drop-out培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組。分別以TDH3p的正向引物和tHMGR的反向引物、tHMGR的正向引物和 PGK1t的反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測目的基因tHMGR的存在。改造后的酵母細(xì)胞命名為SyBE_000955。

將對照菌株SyBE_000954和改造后酵母細(xì)胞 SyBE_000955的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行 GC-TOF/MS檢測，結(jié)果見圖3。由圖可知，與SyBE_000954相比，SyBE_000955的發(fā)酵產(chǎn)物中含有較多鯊烯 (Squalene)，而酵母固醇、麥角固醇等固醇類物質(zhì)的產(chǎn)量并無明顯增加。這表明內(nèi)源基因tHMGR的上調(diào)雖然會(huì)促進(jìn)固醇前體物鯊烯的生成，但鯊烯的大量積累導(dǎo)致原有代謝路徑的平衡被破壞，造成代謝流不通順，鯊烯無法繼續(xù)轉(zhuǎn)化，因此對固醇類物質(zhì)產(chǎn)量的增加影響較小[17]。

2.2.2 下游路徑的優(yōu)化

為促進(jìn)鯊烯的代謝以進(jìn)一步增加底物積累，過表達(dá)酵母固醇合成途徑中的另一關(guān)鍵基因 ERG1[19]。用功能模塊 SyBE_000923轉(zhuǎn)化底盤細(xì)胞SyBE_000954，利用營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)在SC drop-out培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，提取酵母基因組。分別以PGK1p 的正向引物和ERG1的反向引物、ERG1的正向引物和PGK1t的反向引物、TDH3p的正向引物和 tHMGR的反向引物、tHMGR的正向引物和 PGK1t的反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測目的基因ERG1和tHMGR的存在。改造后的酵母細(xì)胞命名為SyBE_000956。

將對照菌株SyBE_000955和改造后酵母細(xì)胞 SyBE_000956的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行 GC-TOF/MS檢測，結(jié)果見圖3。由圖可知，與SyBE_000955相比，SyBE_000956中鯊烯含量降低，而酵母固醇的含量明顯提高。這說明過表達(dá)內(nèi)源基因ERG1編碼的角鯊烯環(huán)氧酶，可以促進(jìn)鯊烯向酵母固醇的轉(zhuǎn)化[15]；功能模塊SyBE_000923的引入，將內(nèi)源基因tHMGR和ERG1同時(shí)上調(diào)，會(huì)使整個(gè)代謝路徑達(dá)到新的平衡，從而優(yōu)化底物酵母固醇的供給代謝，加強(qiáng)與底盤細(xì)胞的適配關(guān)系。

2.3 外源功能模塊與酵母細(xì)胞的適配

以優(yōu)化后的SyBE_000956和本實(shí)驗(yàn)室已有的 SyBE_001344、 SyBE_001358為酵母細(xì)胞，研究外源功能模塊與底盤的適配性。將構(gòu)建的外源功能模塊 SyBE_000937、SyBE_000938、SyBE_000939分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞SyBE_000956、SyBE_001344、SyBE_001358，利用營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)在SC drop-out培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，提取酵母質(zhì)粒。以DHCR24的特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，驗(yàn)證 DHCR24的存在，從而確定陽性克隆。得到的 9種 7-脫氫膽甾醇人工合成細(xì)胞分別命名為 SyBE_000969、SyBE_000970、SyBE_000971、SyBE_000978、SyBE_000979、SyBE_000980、SyBE_000987、SyBE_000988、SyBE_000989。

對上述 9種人工合成細(xì)胞的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行GC-TOF/MS檢測，其中SyBE_000969發(fā)酵產(chǎn)物的氣質(zhì)圖見圖 4B。從圖 4B可以看出，SyBE_000969的發(fā)酵產(chǎn)物在保留時(shí)間22.62 min檢測到的物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品 7-DHC的保留時(shí)間(圖4A)相同。對該組分進(jìn)行質(zhì)譜分析，與標(biāo)準(zhǔn)品7-DHC的碎片峰 (圖4A)一致，證明該物質(zhì)即為7-DHC。經(jīng)定性分析，另外8種人工合成細(xì)胞的發(fā)酵產(chǎn)物均為7-DHC。

2.3.1 不同強(qiáng)度啟動(dòng)子的影響

圖4 7-DHC標(biāo)準(zhǔn)品、SyBE_000969發(fā)酵產(chǎn)物的氣質(zhì)檢測圖Fig.4 GC-MS identification of 7-DHC and product in SyBE_000969.

研究表明，功能模塊中啟動(dòng)子的強(qiáng)度對于目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的優(yōu)化具有重要影響。Siavash Partow等發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖尚未耗盡時(shí)，啟動(dòng)子TDH3p、PGK1p的調(diào)控強(qiáng)度大體相同，而當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)PGK1p的調(diào)控強(qiáng)度略大于TDH3p[30]。然而Sun的研究表明，TDH3p為強(qiáng)啟動(dòng)子，PGK1p僅為中強(qiáng)型啟動(dòng)子[31]。由此可見，相同啟動(dòng)子在不同培養(yǎng)條件和表達(dá)體系中的調(diào)控強(qiáng)度不完全一致，這可能跟外源功能模塊中啟動(dòng)子與底盤細(xì)胞的適配程度、目標(biāo)產(chǎn)物的差異等因素有關(guān)。

本研究根據(jù)7-DHC標(biāo)準(zhǔn)曲線，對上述人工合成細(xì)胞中的7-DHC進(jìn)行定量分析，分析結(jié)果見圖5?？梢钥闯?，在相同底盤細(xì)胞的情況下，外源功能模塊中啟動(dòng)子調(diào)控強(qiáng)度的不同會(huì)影響外源基因的表達(dá)量，其中 TDH3p調(diào)控的基因DHCR24表達(dá)量最高，PGK1p居中，受TDH1p控制的基因表達(dá)量最低。結(jié)果說明受TDH3p調(diào)控的 7-脫氫膽甾醇合成功能模塊與底盤細(xì)胞的適配性最佳，PGK1p的調(diào)控強(qiáng)度居中，TDH1p調(diào)控的功能模塊與酵母底盤的適配性最差。

2.3.2 不同酵母細(xì)胞的影響

由圖 5可以看出，不同酵母細(xì)胞與外源功能模塊的適配性對7-DHC的合成產(chǎn)生重要的作用。以SyBE_000956為底盤的人工合成細(xì)胞，7-DHC含量較高；以 SyBE_001344、SyBE_001358為底盤的人工合成細(xì)胞，7-DHC產(chǎn)量相對較低，且兩種底盤對產(chǎn)量的影響稍有差異，以 SyBE_001358為底盤的人工細(xì)胞，7-DHC產(chǎn)量最低。分析原因，可能是由于SyBE_001344和SyBE_001358兩種底盤中麥角固醇合成途徑未受抑制，酵母固醇向麥角固醇轉(zhuǎn)化導(dǎo)致。Souza等和Denis Pompon等在分別研究能夠生產(chǎn)膽固醇的酵母工程菌時(shí)，也都發(fā)現(xiàn)敲除了內(nèi)源基因ERG6和ERG5的酵母菌株能夠更穩(wěn)定的合成膽固醇[15,22]。此外，由于SyBE_001344和SyBE_001358兩種底盤過表達(dá)了內(nèi)源基因ERG20，使FPP產(chǎn)量提高并向萜類物質(zhì)GGPP方向轉(zhuǎn)化，不利于底物酵母固醇的積累。Zhou等在萜類合成的研究中便發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源基因ERG20與BTS1的融合表達(dá)，可以有效提高FPP由GGPP向次丹參二烯的轉(zhuǎn)化[32]。這也是造成以 SyBE_001344、SyBE_001358為底盤的人工合成細(xì)胞中7-DHC產(chǎn)量較低的原因。但與 3種底盤細(xì)胞適配性最強(qiáng)的功能模塊均為啟動(dòng)子TDH3p所調(diào)控，體現(xiàn)出功能模塊與底盤細(xì)胞適配關(guān)系的規(guī)律性。

圖5 9種人工合成細(xì)胞的7-DHC產(chǎn)量Fig. 5 7-DHC production of different artificial synthetic cells.

3 結(jié)論

在底盤細(xì)胞相同的情況下，外源功能模塊中啟動(dòng)子的調(diào)控強(qiáng)度會(huì)影響外源基因的表達(dá)。與啟動(dòng)子PGK1p、TDH1p相比，TDH3p調(diào)控的7-脫氫膽甾醇合成功能模塊與底盤細(xì)胞的適配性最佳。

受同一啟動(dòng)子調(diào)控的功能模塊與不同底盤細(xì)胞的適配性不同。以SyBE_000956為底盤的人工細(xì)胞具有更強(qiáng)的適配性，其 7-DHC產(chǎn)量最高。

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