NAC-1特異的siRNA增強紫杉醇誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞凋亡*

桂 玲， 王 靜， 祝愛珍， 劉成成， 劉革修△

(1湖南省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，湖南 長沙 410013；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

1000-4718(2012)03-0439-06

2011-09-29

2011-11-07

湖南省衛(wèi)生廳科研計劃資助項目(No.B2011-089)

△通訊作者 Tel：020-85220262；E-mail: tliugx@jnu.edu.cn

NAC-1特異的siRNA增強紫杉醇誘導(dǎo)的人卵巢癌細(xì)胞凋亡*

桂 玲1， 王 靜1， 祝愛珍2， 劉成成2， 劉革修2△

(1湖南省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，湖南 長沙 410013；2暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液病研究所, 廣東 廣州 510632)

目的探討NAC-1 (nucleus accumbens-1)基因特異的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)聯(lián)合紫杉醇誘導(dǎo)人卵巢癌HO8910細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用及其可能機制。方法測定不同濃度NAC-1基因特異的siRNA與紫杉醇單用或者合用對HO8910細(xì)胞增殖與凋亡的作用，設(shè)立陰性siRNA對照和空白對照。以實時熒光定量RT-PCR 檢測NAC-1 mRNA表達(dá)水平、Western印跡法檢測NAC-1蛋白、表皮生長因子受體(EGFR)下游信號磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK),以MTT法檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布和凋亡。結(jié)果單用NAC-1基因特異的siRNA作用48 h能抑制HO8910細(xì)胞NAC-1 mRNA和蛋白的表達(dá)，分別下調(diào)71.2%和80.5%，細(xì)胞周期被阻滯于G1期，p-Akt和p-ERK蛋白水平分別下降43.7%和49.8%；作用72 h細(xì)胞增殖被抑制45.6%，與轉(zhuǎn)染陰性siRNA 及未轉(zhuǎn)染組比較，差異顯著(P<0.05)。NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)與紫杉醇(2 μmol/L)聯(lián)合作用于卵巢癌HO8910細(xì)胞72 h細(xì)胞凋亡率為(30.93±4.57)%，顯著高于單用紫杉醇時的細(xì)胞凋亡率[(23.85±3.65)%]，P<0.05。結(jié)論靶向抑制NAC-1基因表達(dá)能顯著抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖，增強其對紫杉醇的敏感性，這與部分抑制EGFR下游信號途徑有關(guān)。

Nucleus accumbens-1蛋白； 紫杉醇； 卵巢腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡

紫杉醇(paelitaxel)是目前治療卵巢癌的重要藥物，有效改善了卵巢癌患者的生存率。但是臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其存在一些缺陷，一方面癌細(xì)胞對其易產(chǎn)生耐藥性，另一方面，患者出現(xiàn)骨髓抑制、過敏反應(yīng)、胃腸道反應(yīng)、神經(jīng)毒性反應(yīng)、心臟毒性反應(yīng)、關(guān)節(jié)/肌肉痛、肝臟毒性反應(yīng)、腎臟毒性反應(yīng)等不良反應(yīng)。所以，研究增強其抗癌效果和/或者減少其不良反應(yīng)的方法具有重要意義。

最近研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及其治療效果與卵巢癌干細(xì)胞具有密切關(guān)系[1-7]。Nakayama等[8]和Jinawath等[9]研究不僅發(fā)現(xiàn)NAC-1 (nucleus accumbens-1)是一種極強的干細(xì)胞因子，而且證實在漿液性卵巢癌組織和細(xì)胞株中NAC-1表達(dá)和紫杉醇體外耐藥相關(guān)，通過部分抑制Gadd45gip1的表達(dá)、負(fù)向調(diào)節(jié)Gadd45腫瘤抑制途徑的組成包括Gadd45α和其結(jié)合蛋白Gadd45gip1，從而促進腫瘤的生長和存活。所以，為了增強紫杉醇作用、減少其不良反應(yīng)，本研究采用RNA干擾技術(shù)沉默NAC-1基因以協(xié)同紫杉醇抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，探索卵巢癌治療的新的聯(lián)合方法，為臨床提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料和試劑

人卵巢癌細(xì)胞系HO8910購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，由暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生殖研究室保存；RPMI-1640培養(yǎng)液購于Gibco；新生牛血清購于杭州四季青生物工程科技有限公司；MTT購于Sigma；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000購于Invitrogen；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenⅠMix試劑盒購自Tiangen;MTT試劑盒、蛋白裂解液和電化學(xué)發(fā)光(electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；以NAC-1基因為靶標(biāo)的特異性siRNA和陰性對照siRNA均由廣州市銳博生物科技有限公司合成及純化。磷酸化Akt[phosphorylated Akt，p-Akt(Ser473)]多克隆抗體購自Santa Cruz；NAC-1多克隆抗體和磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)多克隆抗體購自Cell Signaling Technology。

2靶向NAC-1基因寡核苷酸的設(shè)計

根據(jù)NAC-1基因的序列號NM-052876.21，遵循siRNA設(shè)計規(guī)則設(shè)計siRNA序列，使用BLAST程序?qū)π蛄羞M行人類基因組相似性評估證實序列在人類基因組中具有唯一性。經(jīng)預(yù)實驗篩選出NAC-1基因特異性高效的siRNA：5’-UGACAGGCACCAACGUGUACA-3’；陰性對照siRNA：5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’，與已知的人類基因無同源性。

3細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組

將對數(shù)生長期的人卵巢癌HO8910細(xì)胞以1×105細(xì)胞/瓶接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長至約70%匯合度時，以每孔100 μL(5×103細(xì)胞)接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的紫杉醇(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0 μmol/L)、不同濃度的NAC-1-siRNA(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60和3.20 μmol/L)以及NAC-1 siRNA 0.5 μmol/L，此濃度根據(jù)單用NAC-1 siRNA的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)確定]聯(lián)合不同濃度的紫杉醇(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和32.0 μmol/L)，進行藥物干預(yù)，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。同時設(shè)空白對照組、僅含有DMSO的陰性對照組和陰性siRNA (negative siRNA)組。siRNA轉(zhuǎn)染參考試劑盒說明書。

4MTT法檢測細(xì)胞增殖活性

繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT(5 g/L)10 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h后低速離心10 min吸棄上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩15 min使沉淀充分溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長490 nm處測定吸光度(A)值。細(xì)胞生長抑制率=(實驗組平均A值-空白組平均A值)/(對照組平均A值-空白組平均A值)×100%。采用直線回歸方法計算藥物的IC50值。實驗重復(fù)3次。

5細(xì)胞周期與凋亡檢測

采用PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：siRNA處理48 h后，收集、洗滌細(xì)胞，冰預(yù)冷的70%乙醇，4 ℃固定24 h；離心去乙醇, PBS漂洗,加入50 mg/L PI、20 mg/L RNase、1 g/L枸櫞酸鈉、1% Triton X-100,上機檢測。采用AnnexinⅤ/PI雙熒光染色法分析細(xì)胞凋亡：收集siRNA、紫杉醇單用或者聯(lián)用72 h后的細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L。吸取100 μL細(xì)胞懸液，加入AnnexinⅤ-FITC溶液5 μL，輕輕混勻后室溫避光孵育15 min，再加碘化丙啶(propidium iodide，PI)10 μL，混勻后避光并室溫下孵育5 min，加入結(jié)合緩沖液400 μL，立即上流式細(xì)胞儀分析。以未染色細(xì)胞調(diào)零，以AnnexinⅤ-FITC單染管和PI單染管作為基準(zhǔn)對照，測定每個上樣管數(shù)據(jù)，測定凋亡細(xì)胞百分比。

6計算紫杉醇和NAC-1siRNA的聯(lián)合作用效果

根據(jù)中效原理，采用Chou-Talalay聯(lián)用指數(shù)法[10]來判定2種藥物對HO8910細(xì)胞增殖的聯(lián)合作用。按中效方程式計算出不同抑制率時兩藥的單用和聯(lián)用濃度，公式如下：D=Dm[fa/(1-fa)]1/m；式中D為藥物濃度，Dm為中效濃度，fa為細(xì)胞增殖抑制率，m為斜率。2種藥物的聯(lián)用指數(shù)(combination index，CI)的計算公式如下：CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2+a(D)1(D)2/ (Dx)1(Dx)2；其中(Dx)1和(Dx)2分別為2種藥物單用時產(chǎn)生某一效應(yīng)值fa時的濃度，(D)1和(D)2則是2種藥物聯(lián)用時產(chǎn)生相同效應(yīng)fa時各自所需要的濃度。當(dāng)2種藥物的相互作用為非排斥性時，a=1；當(dāng)2種藥物的相互作用為排斥性時，a=0。求出CI值，如果CI<1，認(rèn)為兩藥物聯(lián)用為協(xié)同作用；如果CI=1，認(rèn)為兩藥聯(lián)用為相加作用；如果CI>1，則認(rèn)為兩藥聯(lián)用為拮抗作用。

7實時熒光定量RT-PCR法檢測NAC-1mRNA表達(dá)

處理48 h后收集細(xì)胞，提取總RNA并用紫外分光光度計定量，取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板、NAC-1基因特異性引物進行實時熒光定量PCR分析，根據(jù)2-ΔΔCt方法分析目的基因的mRNA相對表達(dá)水平。NAC-1基 因 上 游 序 列 為 5 ’ - CCAGACACTGCAGATGGAGA-3’，下游序列為5’-AAGCTGAGGATCTGCTGGAA-3’，擴增片段為227 bp；內(nèi)參照GAPDH 上游序列為5’-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3’，下游序列為5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’，擴增片段為219 bp。

8Western印跡法檢測蛋白水平

處理48 h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量。取等量蛋白30 μg上樣，進行10%SDS-PAGE，120 V恒壓電泳1 h，200 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。然后，用含5%脫脂奶粉的TBST對膜封閉30 min，加入抗人NAC-1、p-Akt(Ser473)抗體、p-ERK抗體或兔抗人GAPDH抗體(Sigma)于4 ℃孵育過夜，第2 d加入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的相應(yīng)Ⅱ抗IgG(稀釋比例為1∶3 000)于室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次。最后，ECL發(fā)光顯色，采集圖像，采用Gel-Pro 4.0軟件對目的蛋白進行定量分析。以GAPDH作為內(nèi)參照。

9統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1NAC-1siRNA、紫杉醇單用或者合用對卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，NAC-1 siRNA和紫杉醇分別以不同濃度單獨作用于HO8910細(xì)胞72 h，均顯示抑制細(xì)胞增殖作用，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，見表1，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NAC-1 siRNA作用72 h的IC50值為(0.82±0.08)μmol/L，而紫杉醇的IC50值為(3.81±0.56)μmol/L。根據(jù)合用指數(shù)計算公式，計算出NAC-1 siRNA和紫杉醇合用在不同效應(yīng)(0.90、0.80、0.75、0.70、0.65、0.60、0.50、0.40)時的CI分別為0.534、0.574、0.593、0.674、0.737、0.835、0.936、0.941。結(jié)果顯示當(dāng)fa為0.90、0.80、0.75、0.65、0.60、0.50、0.40時兩藥作用為協(xié)同。

表1不同濃度NAC-1siRNA與紫杉醇單用或合用對HO8910細(xì)胞的生長抑制率

Drug(μmol·L-1)InhibitoryrateNAC-1siRNA 0.0515.38±1.37 0.1020.42±1.96 0.2027.88±2.81 0.4038.54±3.57 0.8049.43±3.96 1.6065.17±4.35 3.2073.11±4.58Paelitaxel 0.57.34±1.65 1.013.72±1.85 2.031.99±2.32 4.055.87±3.80 8.067.74±4.92 16.078.91±5.15 32.082.20±5.06NAC-1siRNA+paelitaxel 0.5+0.545.63±3.68* 0.5+1.053.47±4.31* 0.5+2.067.90±4.93* 0.5+4.079.50±5.23* 0.5+8.083.75±5.49* 0.5+16.090.00±5.53* 0.5+32.092.52±5.86

*P<0.05vsthe concentration-matched paelitaxel groups.

2NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細(xì)胞NAC-1基因表達(dá)水平的影響

實時熒光定量PCR和Western印跡法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染NAC-1特異siRNA(0.5 μmol/L)能有效沉默NAC-1基因的表達(dá), NAC-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平分別下降71.2%和80.5%，與空白對照組、陰性siRNA組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ，見圖1A、B。

圖1NAC-1基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染對卵巢癌HO8910細(xì)胞細(xì)胞中NAC-1基因表達(dá)的影響

3NAC-1siRNA單用對卵巢癌HO8910細(xì)胞表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)下游信號分子活性的影響

Western blotting結(jié)果顯示，0.5 μmol/L濃度的NAC-1 siRNA能抑制EGFR活性，其下游信號蛋白Akt和ERK活性被抑制，作用48 h后，不僅NAC-1蛋白水平顯著下降，而且細(xì)胞p-Akt和p-ERK活性水平也顯著下降，分別下降(43.70±4.25)%和(49.80±4.38)%，見圖2。

Figure 2. Effects ofNAC-1 siRNA on NAC-1 protein and the activity of protein kinases of EGFR downstream signaling pathway in ovarian cancer HO8910 cells. Con：control; Neg：negative siRNA; Exp：NAC-1 siRNA.

圖2NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細(xì)胞NAC-1蛋白和EGFR信號途徑下游蛋白激酶活性的影響

4NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細(xì)胞周期分布的影響

細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，空白對照組與陰性siRNA組中卵巢癌HO8910細(xì)胞的細(xì)胞周期分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染NAC-1 siRNA后G1期HO8910細(xì)胞比例顯著增高(P<0.05)，見圖3、表2，提示NAC-1 siRNA轉(zhuǎn)染能夠阻滯細(xì)胞周期在G1期。

5NAC-1siRNA單用或者與紫杉醇合用對卵巢癌HO8910細(xì)胞凋亡的影響

FCM法檢測結(jié)果顯示，用濃度低于IC50的NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)或紫杉醇(2.0 μmol/L)單獨作用于卵巢癌HO8910細(xì)胞72 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(7.63±2.38)%和(23.85±3.65)%；而將NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)和紫杉醇(2.0 μmol/L)聯(lián)合作用72 h后，HO8910細(xì)胞的凋亡率為(30.93±4.57)%。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率高于單獨用藥組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；且隨著兩者的濃度增加，細(xì)胞凋亡率亦呈增高趨勢。由此可見，NAC-1 siRNA可增強紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

Figure 3. Effect ofNAC-1 siRNA on cell cycle distribution of ovarian cancer HO8910 cells analyzed by flow cytometry.

圖3FCM法檢測NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細(xì)胞周期分布的影響

表2NAC-1siRNA對卵巢癌HO8910細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響

GroupG0/G1SG2/MControl42.38±5.7324.92±4.4731.70±4.74NegativesiR-NA45.68±5.9522.45±4.6031.87±4.66NAC-1siRNA62.53±6.73*12.99±3.1024.48±3.84

*P<0.05vscontrol.

討 論

NAC-1屬于BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員，是干細(xì)胞多能性因子。NAC-1通過調(diào)節(jié)其它多能分化因子的表達(dá)，如Nanog、Oct4、Sox2、Klf4、Sall1 和 Sall4等，參與蛋白質(zhì)間的相互作用和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與胚胎干細(xì)胞的自我更新和多能性分化，對胚胎干細(xì)胞的多能分化是至關(guān)重要的[8]。最近研究顯示，NAC-1在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括：胰癌、大腸癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、肝癌和宮頸癌[11]。Ishibashi等[12]在卵巢癌研究中發(fā)現(xiàn)化療后復(fù)發(fā)的患者體內(nèi)NAC-1表達(dá)水平明顯高于初發(fā)未治者。Nakayama等[8]和Jinawath等[9]則不僅證實在漿液性卵巢癌組織和細(xì)胞株中NAC-1表達(dá)和紫杉醇體外耐藥相關(guān)，而且發(fā)現(xiàn)，NAC-1通過部分抑制Gadd45gip1的表達(dá)、負(fù)向調(diào)節(jié)Gadd45腫瘤抑制途徑的組成包括Gadd45α和其結(jié)合蛋白Gadd45gip1，從而促進腫瘤的生長和存活。Ueda等[13]則發(fā)現(xiàn)NAC-1對于維持卵巢癌細(xì)胞中脂肪酸合成酶蛋白和mRNA水平的表達(dá)必不可少，并與卵巢癌復(fù)發(fā)有關(guān)。這些資料表明，NAC-1是高度惡性的卵巢癌復(fù)發(fā)相關(guān)基因。

本研究結(jié)果顯示，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將NAC-1 siRNA導(dǎo)入卵巢癌細(xì)胞后，不僅能有效沉默NAC-1基因，抑制NAC-1 mRNA與蛋白表達(dá)，而且細(xì)胞的生長活性明顯受到抑制、細(xì)胞周期被阻滯于G1期，同時部分抑制EGFR下游信號途徑，p-Akt和p-ERK水平顯著下降；NAC-1 siRNA和紫杉醇合用則進一步增強了紫杉醇誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞凋亡作用。結(jié)果表明NAC-1在卵巢癌細(xì)胞的生長和存活中起著重要的作用，NAC-1 siRNA能提高卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。這為改善卵巢癌臨床治療方法提供新的依據(jù)。

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NAC-1-specificsiRNAenhancespaelitaxel-inducedapoptosisofovariancancercelllineHO8910

GUI Ling1, WANG Jing1, ZHU Ai-zhen2, LIU Cheng-cheng2, LIU Ge-xiu2

(1DepartmentofGynecologicOncology,HunanProvincialTumorHospital,Changsha410013,China;2InstituteofHematology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect ofNAC-1-specific siRNA alone, or in combination with paelitaxel on proliferation and apoptosis of human ovarian cancer cell line HO8910.METHODSOvarian cancer cells were treated withNAC-1 siRNA alone or in combination with paelitaxel. The level of NAC-1 mRNA was assessed by real-time quantitative PCR. Western blotting analysis was used to detect NAC-1 protein and the activation of epidermal growth factor receptor(EGFR) downstream signals,Akt and ERK. The cell proliferation rate was measured by MTT assay, and the cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry.RESULTSAfter treated withNAC-1-specific siRNA for 48 h, the expression of NAC-1 at mRNA and protein levels in HO8910 cells decreased by 71.1% and 80.5%, respectively. The cells in G1phase increased. The protein levels of p-Akt and p-ERK were decreased by 43.7% and 49.8%, respectively. After treated withNAC-1-specific siRNA for 72 h, the proliferation inhibitory rate of the cells was increased to 45.6% as compared with the cells treated with negative siRNA. Apoptotic rate of the cells treated withNAC-1 siRNA (0.5 μmol/L combined with 2 μmol/L of paelitaxel) for 72 h was (30.93±4.57)%,higher than that of the cells treated with paelitaxel alone[(23.85±3.65)%].CONCLUSIONNAC-1 siRNA suppressesNAC-1 gene expression and EGFR downstream signaling activation, inhibits cell proliferation and enhances the responsiveness of ovarian cancer cells to paelitaxel. The combination treatment produces synergistic inhibition.

Nucleus accumbens-1 protein; Paelitaxel; Ovarian neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis

R737.14

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.010