苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Gp64蛋白的優(yōu)化表達

徐智鵬，張佑紅，張楠，翟莉莉，黃雙成，陳杏洲

（武漢工程大學化工與制藥學院，綠色化工過程教育部重點實驗室，湖北 武 漢430074）

0 引言

苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒是桿狀病毒科核型多角體病毒屬的典型代表，能感染30多種鱗翅目昆蟲，該病毒的基因組是大小為134kb的環(huán)狀單一雙鏈DNA分子，編碼約90種蛋白質(zhì)．由于昆蟲桿狀病毒DNA具有大量的非復制必需區(qū)，能容許基因缺失或替換，具有較大的可操作性，能夠容納大片段外源DNA的插入，因此可以用作外源基因的表達載體［1－3］．感染宿主后的核型多角體病毒有兩種表型：一種為包涵體病毒（OV），另一種則為非包涵體病毒（BV）［4－5］．目前只在BV中發(fā)現(xiàn)Gp64蛋白，其集中在桿狀病毒BV顆粒的一端，是第三類過濾性的膜融合蛋白，病毒感染的早期和晚期均能表達這個蛋白，是病毒通過吸附、包吞作用進入宿主細胞的關鍵功能蛋白之一［6－7］，它在出芽病毒吸附內(nèi)吞進入細胞的過程中作pH依賴型的膜融合蛋白，通過與胞飲體膜融合而使病毒粒子進入到細胞內(nèi)．最近的研究也報道了這個蛋白可以促進桿狀病毒進入成熟間葉細胞和胚胎干細胞等哺乳動物細胞，這意味著桿狀病毒可作為有效的基因傳遞載體用于基因治療．本研究克隆了來自苜蓿銀紋核型多角體病毒的Gp64蛋白編碼基因，將去掉了囊膜編碼區(qū)的截短基因?qū)氪竽c桿菌進行原核表達，并采用不同表達條件對表達水平進行了優(yōu)化．本研究的結果將為深度解析GP64基因在苜蓿銀紋核型多角體病毒感染過程中的功能奠定基礎［8－9］．

1 材料和方法

1．1 實驗材料 pET28a（＋）Gp64重組質(zhì)粒由本實驗室自行構建，大腸桿菌BL21（DE3）由本實驗室保存．

1．2 試驗方法

1．2．1 重組菌的培養(yǎng) 挑取含有pet28a（＋）Gp64重組菌的保種液在含卡那霉素（50μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)12h后挑取單菌落接種到20mL含卡那霉素（50μg／mL）的LB培養(yǎng)基中，于37℃，200r／min振蕩培養(yǎng)過夜，活化細菌．測定其OD600nm＝1．529．

1．2．2 不同培養(yǎng)基條件下的表達 將活化好的細菌分別按照5%的接種量接種到10mL LB－kan、SOC－kan、SOB－kan和LB－kan＋10%甘油液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3h后，對重組菌進行誘導表達．測其細菌OD600nm值．收集1mL非誘導和誘導后的大腸桿菌菌液，12 000r／min離心1min后加入100μL pH8．0的PBS重懸，加入50μL上樣緩沖液煮沸10min后進行SDS－PAGE．利用SDS－PAGE分析Gp64蛋白在各個培養(yǎng)基中的相對表達量［10］．

1．2．3 不同接種量條件下的表達 將活化好的細菌分別按照1%、5%、7%、10%和15%的接種量到10mL LB－kan培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)3h后，對重組菌進行誘導表達．測其細菌OD600nm值．利用SDSPAGE（電泳樣品處理同前）分析Gp64蛋白在各個培養(yǎng)基中的相對表達量．

1．2．4 不同溫度條件下的表達 將活化好的細菌接種到40mL LB－kan培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)3h后加入相同終濃度的IPTG，等分成4份，分別放置16℃、22℃、30℃和37℃條件下進行誘導表達；同時將活化好的細菌分別接種到10mL LB－kan培養(yǎng)基中于22℃、30℃培養(yǎng)3h后加入相同終濃度的IPTG后在30℃下進行誘導表達．測其細菌OD600nm值．利用SDS－PAGE（電泳樣品處理同前）分析Gp64蛋白在不同培養(yǎng)溫度和誘導溫度下的相對表達量．

1．2．5 不同誘導時間條件下的表達 將活化好的細菌按10%接種到60mL LB－kan培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)3h后入IPTG至終濃度為0．3mmol／L后均分6份．分別在30℃誘導表達1h、3h、5h、7h、9h和12h．測其細菌OD600nm值．利用SDS－PAGE（電泳樣品處理同前）分析Gp64蛋白在不同誘導時間下的相對表達量［11］．

1．2．6 不同誘導劑濃度條件下的表達 將活化好的細菌按10%接種到60mL LB－kan培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3h后，均分為6份．分別加入IPTG 至終濃度分別為0．1mmol／L、0．3mmol／L、0．5mmol／L、0．7mmol／L、0．9mmol／L、1．2mmol／L后進行誘導表達．測其細菌OD600nm值．利用SDS－PAGE（電泳樣品處理同前）相對定量分析Gp64蛋白在不同終濃度誘導劑的條件下的表達量［12］．

2 結果和分析

2．1 培養(yǎng)基對重組菌生長和蛋白表達的影響 根據(jù)實驗方案分別在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h后和誘導5h后測OD600nm發(fā)現(xiàn)，使用LB培養(yǎng)基能得到最大的生物量．如表1所示，最大的菌體OD600nm值為2．459．根據(jù)表1分析可以得出LB培養(yǎng)基最適合該重組菌的生長繁殖．

SDS－PAGE電泳圖（圖1）顯示使用LB培養(yǎng)基能夠得到最高的蛋白表達量．

表1 不同培養(yǎng)基在培養(yǎng)3h和誘導5h后的OD600nm值

2．2 接種量對重組菌生長和蛋白表達的影響 按照實驗方案分別使用不同接種量，在培養(yǎng)3h和誘導5h后測OD600nm發(fā)現(xiàn)并不是接種量越高，測的OD600nm值越大．如表2所示，該表說明了當接種量為10%的時候在培養(yǎng)3h和誘導5h后能得到最大的細菌生物量，最大OD600nm值為2．578．不論是培養(yǎng)過程還是誘導過程，培養(yǎng)基的成分對細菌生長都存在一個極限值，在培養(yǎng)相同時間下，達到極限值之前隨著接種量的增大而增大，達到極限值后就會隨著接種量的增大而變小．

圖1 培養(yǎng)基對Gp64蛋白表達的影響

OD600nm和電泳圖片（圖2）顯示在接種量為10%時候蛋白表達量最高．分析結果可得，并不是接種量越多生成目的蛋白越多，因為接種量相對過多時，細菌之間存在生長競爭，反而會抑制其代謝，使目標蛋白產(chǎn)率降低．

2．3 溫度對重組菌生長和蛋白表達的影響 在不同培養(yǎng)溫

度下培養(yǎng)3h后測細菌菌液OD600nm值發(fā)現(xiàn)在37℃的時候有最大值1．621．在不同的溫度下誘導5h后測OD600nm發(fā)現(xiàn)，在30℃誘導5h后得到最大值2．598．SDS－PAGE電泳圖（圖3）顯示在37℃條件下培養(yǎng)，30℃誘導的條件下表達的蛋白量最高．分析可得到重組細菌的最佳生長繁殖溫度為37℃，但最佳表達溫度為30℃．

表2 不同接種量下培養(yǎng)3h和誘導5h后的OD600nm

2．4 不同誘導時間對蛋白表達的影響 在培養(yǎng)相同時間后，得到相同的菌液量．分別加入終濃度為0．3mmol／L IPTG后經(jīng)不同誘導時間誘導后測定OD600nm值．圖4顯示了在12h內(nèi)細菌生物量都在隨誘導時間的增加而增加，12h后基細菌量維持在一個量左右且在慢慢減小，但在培養(yǎng)5h時細菌生殖速率最快．SDS－PAGE電泳圖片（圖5）顯示在30℃誘導5h表達量最高．當培養(yǎng)5h左右，菌體增長速率最快，此時菌體代謝最旺盛，蛋白的表達效率最高．

圖2 接種量對Gp64蛋白表達的影響

圖3 溫度對Gp64蛋白表達的影響

圖4 不同誘導時間下OD600nm值

2．5 不同誘導劑濃度對蛋白表達的影響 在按上述實驗方法操作后，分別加入不同體積的IPTG誘導表達．測定其細菌OD600nm值如圖6所示，該圖顯示在IPTG為0．3mmol／L左右的時候有最大的生物量．當IPTG的濃度過低或過高都會抑制細菌的生長繁殖．分析細菌OD600nm和觀察電泳圖片（圖7）發(fā)現(xiàn)在誘導劑IPTG濃度為0．3mmol／L的時候蛋白的表達量最大．

圖5 誘導時間對Gp64蛋白表達的影響

圖6 不同的誘導劑濃度下的OD600nm

圖7 IPTG濃度對Gp64蛋白表達的影響

3 討論

利用基因工程技術在E．coli中高水平表達外源基因從而獲得大量異源蛋白，是現(xiàn)代分子生物學的巨大成就之一．大腸桿菌作為基因工程表達的首選宿主，具有生產(chǎn)周期短、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)點．但外源基因在表達過程中，往往會遇到表達效率與產(chǎn)率低等困難．影響外源基因在大腸桿菌中表達的因素很多．本研究就培養(yǎng)基、pH、接種量、誘導溫度、誘導時間和誘導劑濃度進行優(yōu)化，最終確定了大腸桿菌表達Gp64蛋白的最佳條件為：pH為自然條件下的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3h，30℃誘導表達5h，IPTG終濃度為0．3mmol／L．在此之前構建全長Gp64基因表達Gp64蛋白，盡管通過測序檢測該序列的正確性，但是依舊無法正常誘導表達全長Gp64蛋白，可能是因為其跨膜區(qū)域的存在，影響了表達蛋白的正常折疊，而無法形成正常的蛋白．同時進行稀有密碼子分析發(fā)現(xiàn)，在其跨膜區(qū)的位置稀有密碼子大量出現(xiàn)，可能導致蛋白翻譯在此無法正常進行，進而無法正常編碼蛋白質(zhì)［13－14］．所以在切掉全長Gp64基因的跨膜區(qū)，重新構建重組子，表達截短Gp64蛋白．表達Gp64蛋白為研究Gp64蛋白及其受體在病毒感染過程中的定位、分布及其功能研究奠定了工作基礎．Gp64蛋白截短后改變了蛋白的部分結構，部分功能也發(fā)生了改變，但得到的重組截短Gp64蛋白仍然保留其免疫原性，可以通過制備抗體或蛋白質(zhì)體外相互作用等來開展進一步的研究，對后續(xù)的研究工作或結果不會產(chǎn)生較大的負面影響．

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