pH響應(yīng)兩親性殼聚糖衍生物的合成與表征

于妙卓，費(fèi)學(xué)寧，張寶蓮，李旭坤，茈夢(mèng)雨

(天津城建大學(xué) a. 材料科學(xué)與工程學(xué)院；b. 理學(xué)院，天津 300384)

殼聚糖作為一種天然聚合物，具有生物相容性、生物可降解性、低免疫原性和低生物活性等良好的生物學(xué)性質(zhì)[1-2].文獻(xiàn)報(bào)道，兩親性殼聚糖衍生物形成的膠束可成功對(duì)疏水性藥物進(jìn)行增溶.

為了提高藥物治療的有效應(yīng)和安全性，提高藥物的生物利用度，降低對(duì)人體正常組織的損傷，“智能型”聚合物膠束引起了科研人員的廣泛興趣.大多數(shù)實(shí)體瘤的 pH值(pH＜6.5)都低于周圍正常組織(pH=7.5)，利用這種變化可設(shè)計(jì) pH敏感的釋藥系統(tǒng).此外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)涵體和溶酶體的 pH值(pH=5.0～6.0)要明顯低于細(xì)胞外pH值，當(dāng)膠束進(jìn)入細(xì)胞后響應(yīng)其pH環(huán)境的變化，從而使釋藥增加實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞器的靶向釋藥[3-5].向聚合物中引入pH敏感基團(tuán)，通過在不同pH介質(zhì)中膠束結(jié)構(gòu)的改變致使膠束親水性被破壞而釋放藥物[6].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，質(zhì)子化的聚合物即帶胺基、吡啶或者咪唑基等堿性基團(tuán)的弱堿性聚合物或帶羧酸基團(tuán)的弱酸性聚合物，當(dāng)pH值發(fā)生改變時(shí)，這類聚合物的離子化狀態(tài)也發(fā)生改變，導(dǎo)致它們?cè)谒械娜芙庑园l(fā)生變化.其中帶羧基的弱酸性聚合物在酸性條件下質(zhì)子化后不溶于水，而在堿性條件下溶于水.

本文以低分子量殼聚糖為主鏈，與辛醛通過還原席夫堿的方法引入了疏水長(zhǎng)鏈烷基，并在酸性條件下用琥珀酸酐改性，合成了兩親性殼聚糖衍生物.研究了此聚合物在水中自聚集現(xiàn)象和在不同pH介質(zhì)中的行為變化.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(分子量＜5000，脫乙酰度＞85%)，濟(jì)南海得貝海洋生物有限公司；辛醛(純度≥99.0%)，硼氫化鈉(純度≥98.0%)，甲基磺酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；琥珀酸酐，天津市博迪化工有限公司；芘(98%)，阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司；其余試劑均為分析純.

Thermo Nicolet380傅里葉紅外變換光譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Nicole公司；日立F-7000熒光分光光度計(jì)，美國(guó) VARIAN公司；紫外分光光度計(jì)，美國(guó)TA公司；ZS90 ZETA納米粒徑電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；Q20差示掃描量熱儀，美國(guó)PerkinElmer公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 N-辛基殼聚糖制備

CS(殼聚糖＜5 kDa，4.0 g)在三口瓶中溶于無水甲醇(120 mL)，置于30 ℃水浴中不斷機(jī)械攪拌，向體系緩慢滴加辛醛(11.3 mL)，滴加完畢后保溫反應(yīng)36 h.向體系分10批次加入NaBH4(3 g)，室溫還原反應(yīng)24 h，用1 mol/L的 NaOH調(diào)反應(yīng)液pH至中性，抽濾，濾餅依次用甲醇、水洗滌，真空干燥得淡黃色粉末.

1.2.2 N-辛基-O N-琥珀酰化殼聚糖制備

稱取0.8 g干燥的N-辛基殼聚糖，加入15 mL甲基磺酸，冰水浴中不斷機(jī)械攪拌20 min，逐滴滴加丁二酸酐/丙酮溶液，劇烈機(jī)械攪拌反應(yīng)3 h，反應(yīng)結(jié)束后移入100 mL燒杯，于-20 ℃冷凍過夜，反應(yīng)液在丙酮中沉淀，抽濾獲得沉淀，沉淀在蒸餾水中溶解，用氨水調(diào)節(jié) pH至 7.0，沉淀再次析出，抽濾，真空干燥，干燥后的沉淀用丙酮索氏抽提24 h，真空干燥得到黃褐色粉末.

1.3 N-辛基-O,N-琥珀酰化殼聚糖的結(jié)構(gòu)表征

使用 FTIR 380紅外光譜儀測(cè)定產(chǎn)物的紅外光譜；使用 Q20差示掃描量熱儀測(cè)定產(chǎn)物的 DSC.升溫速率 15 ℃/min，起始溫度 25 ℃，終止溫度350 ℃.

1.4 N-辛基-O,N-琥珀酰化殼聚糖膠束性能測(cè)試

1.4.1 臨界膠束濃度(CMC)測(cè)定

采用穩(wěn)態(tài)芘探針法測(cè)定膠束CMC.

1.4.2 膠束紫外透光度和粒徑測(cè)定

分別取1 mL的N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶侨芤?，質(zhì)量濃度為10 mg/ mL，加入到8 mL的pH值分別為 4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5的磷酸鹽緩沖溶液中.用ZETA納米粒徑電位分析儀測(cè)定膠束粒徑，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定 500 nm 處的透光率，使用粒徑和透光率綜合評(píng)價(jià) N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶堑膒H敏感性.

2 結(jié)果與討論

2.1 N-辛基-O,N-琥珀?；瘹ぞ厶堑慕Y(jié)構(gòu)表征

2.1.1 殼聚糖，N-辛基殼聚糖，N-辛基-O N-琥珀酰化殼聚糖紅外光譜

圖1是殼聚糖，N-辛基殼聚糖，N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶堑募t外譜圖.

由圖1可以得到，在N-辛基殼聚糖紅外譜圖中的2925.30 cm-1，2856.74 cm-1處的吸收峰是辛基碳鏈伸縮振動(dòng)峰，表明辛基成功接枝在殼聚糖上，而1652.31 cm-1處吸收峰相比于殼聚糖峰減小，表明消耗了氨基，證明辛基接枝于殼聚糖的氨基上.在 N-辛基-O N-琥珀化殼聚糖紅外光譜中 768.40 cm-1處是C—H苯環(huán)面外振動(dòng)吸收峰.1059.48 cm-1處有強(qiáng)吸收峰是 C—O—C的骨架振動(dòng)峰.1652.31 cm-1處的吸收峰是氨基吸收峰，強(qiáng)度依次減小，證明氨基數(shù)量大幅減少，這是由于接枝辛基和琥珀酸酐消耗了大量的—NH2基.1400.75 cm-1處有強(qiáng)吸收峰是 C—O振動(dòng)峰證明含有羧酸，證明是琥珀酸酐開環(huán)后另一邊形成的羧基.在1196.26 cm-1處有強(qiáng)吸收峰，此峰為酯基吸收峰，證明丁二酸酐接枝在殼聚糖 6位的羥基上形成酯基.綜合上述，可知辛醛接枝在殼聚糖的—NH2上，琥珀酸酐接枝在殼聚糖的—NH2及6位亞甲基的—OH上，使其形成N-辛基-O N-琥珀酰化殼聚糖的兩親性結(jié)構(gòu).

圖1 殼聚糖，N-辛基殼聚糖，N-辛基-O,N-琥珀?；瘹ぞ厶羌t外光譜(由上至下)

2.1.2 DSC分析

圖2中是殼聚糖，N-辛基殼聚糖，N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶堑腄SC曲線圖.

圖2 殼聚糖，N-辛基殼聚糖，N-辛基-O,N-琥珀?；瘹ぞ厶荄SC曲線

圖2中曲線a為殼聚糖DSC曲線，在102.87 ℃有吸熱峰，為游離水的去除峰，殼聚糖在 218.44 ℃時(shí)有放熱峰，為殼聚糖分解.在 225.44 ℃時(shí)有尖銳吸熱峰，為殼聚糖熔融峰.曲線b為N-辛基殼聚糖在 303.43 ℃有一強(qiáng)的放熱峰，可能由于接枝的辛基開始斷裂產(chǎn)生的，225.44 ℃無殼聚糖熔融吸熱峰 說明在—NH2基上引入取代基后，結(jié)晶能力下降，從有序變得無序.曲線 c為 N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶窃?258.60 ℃有一放熱峰，為殼聚糖羥基位所接琥珀酸酐分解產(chǎn)生的.低于N-辛基殼聚糖的放熱峰位置(303.43 ℃)，說明接枝琥珀?；鬅岱€(wěn)定性降低，225.44 ℃無殼聚糖熔融吸熱峰?；?，說明接枝取代后，結(jié)晶能力下降，從有序變得無序.

2.2 N-辛基-O,N-琥珀?；瘹ぞ厶悄z束性能測(cè)試

2.2.1 臨界膠束濃度CMC分析

利用穩(wěn)態(tài)芘作為熒光探針法測(cè)定殼聚糖臨界膠束質(zhì)量濃度值為0.072 mg/mL.

2.2.2 pH敏感性分析

筆者期望 N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶悄軌蛐纬煞€(wěn)定的膠束在體內(nèi)循環(huán)，當(dāng)?shù)竭_(dá)靶細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)的溶酶體(pH＝5.0)或內(nèi)涵體(pH＝6.0)時(shí)，使親水外層能夠響應(yīng)酸性環(huán)境水解而斷裂，釋放包載的藥物.由于正常組織pH值(pH＝7.5)比腫瘤組織的pH值(pH＝6.3～6.8)高，因此本研究考察了比較寬范圍的 pH 環(huán)境(pH 取 4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0 和 7.5).表1為N-辛基-O N-琥珀酰化殼聚糖在不同pH環(huán)境下的平均粒徑.

由表1可看出不同pH條件下N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶橇讲顒e明顯.中性和弱堿性介質(zhì)中，膠束結(jié)構(gòu)完整尺寸較小，保持在500 nm以下；隨著pH的繼續(xù)降低，在pH＜5.5時(shí)膠束粒徑急劇增大，膠束結(jié)構(gòu)破壞.這一現(xiàn)象說明殼聚糖膠束在不同pH環(huán)境下膠束的親水性發(fā)生變化，膠束團(tuán)膨脹程度不同導(dǎo)致粒徑不同[8].在pH為4.5～5.5之間，殼聚糖膠束結(jié)構(gòu)被破壞.圖3為不同pH條件下N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶侨芤旱牧脚c透光率.

表1 N-辛基-O,N-琥珀酰化殼聚糖在不同pH環(huán)境的平均粒徑

圖3 不同pH條件N-辛基-O,N-琥珀?；瘹ぞ厶侨芤旱牧脚c透光率

由圖3可以看出，不同pH緩沖液條件下，隨著pH 值的下降 N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶侨芤涸趐H值4.5～5.5之間透光率急劇減小，粒徑增大，說明N-辛基-O N-琥珀酰化殼聚糖膠束結(jié)構(gòu)破壞[9].綜上所述，N-辛基-O N-琥珀?；瘹ぞ厶蔷哂衟H敏感性，pH敏感范圍為4.5～5.5.

理想的載藥膠束在體循環(huán)中應(yīng)盡量不釋放藥物，到達(dá)靶組織后有效地釋放藥物.本文合成了帶有羧酸基團(tuán)的弱酸性聚合物，該質(zhì)子化聚合物在生理pH條件下穩(wěn)定，而進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，隨著內(nèi)涵體中pH的降低，聚合物的離子化狀態(tài)發(fā)生改變而使其溶解性隨之發(fā)生變化.帶羧基的弱酸性聚合物在酸性條件下質(zhì)子化后不溶于水，膠束結(jié)構(gòu)被破壞從而釋放藥物，使腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物濃度增加，降低了抗腫瘤藥物的不良反應(yīng).

3 結(jié) 語

本文通過低分子量殼聚糖的烷基化和酰基化，合成了具有pH敏感性的兩親性殼聚糖衍生物N-辛基-O N-琥珀酰化殼聚糖，pH敏感范圍為4.5～5.5，為腫瘤靶向載體的制備提供了理論和實(shí)踐基礎(chǔ).

［1］賈利霞. 殼聚糖基聚合物膠束的制備及其體外釋藥研究[D]. 蘭州：蘭州大學(xué)，2009.

［2］珣范雅 . 兩親性殼聚糖衍生物的制備及基礎(chǔ)性質(zhì)研究[D]. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2009.

［3］HU Fu-qiang. pH triggered doxorubicin delivery of PEG ylated glycolipid conjugate micelles for tumor targeting therapy[J]. Molecular Pharmaceutics，2012，9：2469-2478.

［4］CHEN Dai-qin . pH-responsive mechanism of a deoxycholic acid and folate comodified chitosan micelle under cancerous environment[J]. Phys. Chem. B，2013，117：1261-1268.

［5］王曉蕾，劉晨光. pH 響應(yīng)性聚合物膠束及其在抗癌藥物給藥系統(tǒng)中的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)新藥雜志，2010，19(21)：1958-1963.

［6］SUNG HW. pH-responsive nanoparticles shelled with chitosan for oral delivery of insulin：from mechanism to therapeutic applications[J]. Accounts of Chemical Research. 2012，45(4)：19-29.

［7］李紅霞，董曉燕，陳 清. ?；鶜ぞ厶茄苌锏暮铣杀碚骷?pH敏感研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(30)：18397-18400.

［8］錢 駿，姜 晶，曾澤華，等. pH敏感的殼聚糖接枝聚合物的可控合成及載藥性能研究[J]. 合成技術(shù)及應(yīng)用，2011(2)：19-24.

［9］李紅霞，董曉燕，陳 清，等. N-辛基-N’-(2-羧基環(huán)己甲?；?-殼聚糖的制備、表征與 pH敏感性[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012(2)：137-141.