四氫嘧啶羥化酶的研究進(jìn)展

張慶，王青青，鞠建松，徐書(shū)景

河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024

近年來(lái)，四氫嘧啶（ectoine，E）及其衍生物5-羥化四氫嘧啶（hydroxyectoine，HE）在微生物細(xì)胞中作為滲透相溶性物質(zhì)已被廣泛研究，它們不僅具有與其他相容性物質(zhì)（如甜菜堿、糖、氨基酸及其衍生物、多元醇等）相同的滲透調(diào)節(jié)作用，還具有在冷凍、高溫、干燥及氧自由基環(huán)境中保護(hù)細(xì)胞膜、維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的性能[1-2]。雖然四氫嘧啶和5-羥化四氫嘧啶在結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)，作用方面也有很多相似之處，但最近的研究顯示5-羥化四氫嘧啶對(duì)蛋白的保護(hù)作用要優(yōu)于四氫嘧啶和其他相溶性物質(zhì)[3]。

目前5-羥化四氫嘧啶已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)藥、生物制造、化工等行業(yè)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，5-羥化四氫嘧啶不僅可以加入藥物中用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，也可作為化療時(shí)健康細(xì)胞的保護(hù)劑[5]。Harishchan?dra等發(fā)現(xiàn)，5-羥化四氫嘧啶還具有增強(qiáng)人工肺表面活性劑的作用[6]。此外，5-羥化四氫嘧啶還能提高雙鏈DNA的解鏈溫度，可以作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的增強(qiáng)劑[7]。

四氫嘧啶羥化酶（ectoine hydroxylase，EctD）主要負(fù)責(zé)將四氫嘧啶羥基化，轉(zhuǎn)化為5-羥化四氫嘧啶，屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴(lài)性的雙加氧酶超家族（EC 1.14.11）[8-9]。自從發(fā)現(xiàn)EctD以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)EctD產(chǎn)生菌做了廣泛研究。李巖等從極端耐鹽放線菌中克隆獲得5-羥基四氫嘧啶合成相關(guān)基因ectABCD，并分析了這些基因?qū)暝诟啕}脅迫中的作用[10]；Reuter等從需鹽枝芽孢桿菌（Virgibacil?lus salexigens）中克隆獲得目的基因ectD，并對(duì)其蛋白晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理進(jìn)行了解析[11]。我們將就EctD的基因來(lái)源、功能、結(jié)構(gòu)及活性中心等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合分析。

1 四氫嘧啶羥化酶的來(lái)源

擁有ectD基因的微生物在生理、生活方式和棲息地分類(lèi)上相對(duì)多樣化，它們中有的來(lái)自病原菌，如膿腫分枝桿菌（Mycobacterium abscessus）和波氏桿菌屬（Bordetella)的多個(gè)菌株；有的來(lái)自在抗生素生產(chǎn)方面具有重要作用的微生物，如天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）和灰色鏈霉菌（S.griseus）；有的是生長(zhǎng)在極低或極高溫度環(huán)境中的細(xì)菌，如嗜熱芽孢桿菌（Geobacillus sp.Y412MC10）和嗜冷鞘脂單胞菌（Sphingopyxis alaskensis），以及生長(zhǎng)在極端pH環(huán)境中的細(xì)菌，如歐氏堿湖生菌（Alkalilimnicola ehrlichei）；大部分擁有ectD基因的微生物生長(zhǎng)在高鹽或海洋環(huán)境中，如海洋細(xì)菌泊庫(kù)島食烷菌（Alca?nivorax borkumensis SK2）[11]。

Bursy等通過(guò)氨基酸序列比對(duì)檢索發(fā)現(xiàn)，有46株革蘭陽(yáng)性或陰性菌的EctD與需鹽枝芽孢桿菌的EctD的氨基酸同源性高達(dá)61%～73%，其中ectD基因位于ectABC基因簇下游的有30種，而剩余的16株中ectD基因并不與ectABC基因相連[9]。ectD基因片段的大小隨菌株來(lái)源不同而不等，一般約為1 kb，如來(lái)自需鹽色鹽桿菌（Chromohalobacter salexigens）的 ectD-1基因?yàn)?996 bp（GenBank：ABE60347.1），ectD-2基因?yàn)?942 bp（GenBank：ABE57904.1），而來(lái)源于需鹽枝芽孢桿菌的ectD基因?yàn)?00 bp（Gen?Bank：AAY29689.1）[11]。盡管不同來(lái)源的EctD的氨基酸序列同源性有所不同，但它們的保守位點(diǎn)，如與2-酮戊二酸及Fe2+的結(jié)合位點(diǎn)基本相同（圖1），說(shuō)明ectD基因在進(jìn)化上是相對(duì)保守的[1-11]。

序列同源性比對(duì)檢索發(fā)現(xiàn)，ectD與脯氨酸羥化酶基因、人類(lèi)植烷酸-輔酶A羥化酶（phytanoyl-CoA hydroxylase，PhyH）基因具有較高的同源性，同屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴(lài)性的雙加氧酶超家族，都存在結(jié)合Fe2+的保守2-His-1-羧酸酯面三聯(lián)體[9]。不同來(lái)源的EctD與指孢囊菌RH1中L-脯氨酸-4-羥化酶（GenBank：D78338.1）的氨基酸序列同源性為26%～32%[12]。由于以上原因，ectD基因常被誤認(rèn)為脯氨酸羥化酶基因或植烷酸-輔酶A羥化酶基因[2]。

2 四氫嘧啶羥化酶的催化反應(yīng)機(jī)理

EctD屬于Fe2+與2-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶，該家族的酶普遍存在于原核和真核微生物中，能催化多種氧化反應(yīng)，包括環(huán)化反應(yīng)、環(huán)碎裂、C-C鍵斷裂、降低氧飽和度、鹵化及羥化反應(yīng)等[13-14]。在四氫嘧啶羥基化反應(yīng)中，共底物2-酮戊二酸脫去羧基釋放一個(gè)CO2分子從而形成琥珀酸，同時(shí)，氧分子中的一個(gè)氧原子被納入琥珀酸鹽，而另一個(gè)氧原子形成羥基插入四氫嘧啶從而形成5-羥化四氫嘧啶[9]。

3 四氫嘧啶羥化酶的活性檢測(cè)方法

目前EctD的活性檢測(cè)方法主要為高效液相色譜法（HPLC）[15]。四氫嘧啶及羥化四氫嘧啶的檢測(cè)以乙腈/水（80/20，V/V）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，在210 nm處檢測(cè)吸收峰[16]。底物四氫嘧啶及產(chǎn)物羥化四氫嘧啶可以采用C18柱通過(guò)紫外檢測(cè)器直接檢測(cè)[17]，也可以通過(guò)Fmoc-Cl柱前衍生，采用NH2柱通過(guò)熒光檢測(cè)器檢測(cè)[15]，根據(jù)底物和產(chǎn)物的峰面積計(jì)算EctD的催化效率[9]。

雖然EctD的來(lái)源很廣，但其催化條件基本相似，催化過(guò)程中都需要氧氣（劇烈振蕩）、FeSO4、α-酮戊二酸及L-抗壞血酸。Bursy等發(fā)現(xiàn)催化反應(yīng)中僅需要低濃度的FeSO4和抗壞血酸，F(xiàn)eSO4濃度超過(guò)1 mmol/L會(huì)對(duì)EctD的活性產(chǎn)生抑制作用，同樣，5 mmol/L抗壞血酸對(duì)EctD的活性抑制作用達(dá)70%，而加入過(guò)氧化氫酶則有利于提高酶催化活性，加入1.3 kU的過(guò)氧化氫酶可使酶蛋白的催化效率提高5倍[9]。Bursy等對(duì)來(lái)自天藍(lán)色鏈霉菌（S.coelicolor）A3（2）和需鹽枝芽孢桿菌的EctD的酶學(xué)特性進(jìn)行了表征，分析表明二者的催化條件基本相似，對(duì)底物四氫嘧啶和2-酮戊二酸的親和常數(shù)Km也基本相當(dāng)[8]。

將四氫嘧啶的2種衍生物，五元環(huán)化合物［（RS）-4，5-dihydro-2-methyl-imidazole-4-carbox?ylic acid］及七元環(huán)化合物homoectoine［（S）-4，5，6，7-tetrahydro-2-methyl-1H-（1，3）-diazepine-4-carboxylic acid］作為底物，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有得到其羥化產(chǎn)物，說(shuō)明EctD具有高度的底物專(zhuān)一性，僅對(duì)四氫嘧啶（六元環(huán)化合物）具有催化活性[9]。

圖1 四氫嘧啶羥化酶與脯氨酸羥化酶的同源序列比對(duì)（部分）

4 四氫嘧啶羥化酶的空間結(jié)構(gòu)

雖然EctD廣泛存在于各種革蘭陰性和陽(yáng)性細(xì)菌中，其產(chǎn)物5-羥化四氫嘧啶作為相溶性物質(zhì)也被廣泛研究，但有關(guān)EctD空間結(jié)構(gòu)的報(bào)道卻很少。目前僅有來(lái)自需鹽枝芽孢桿菌的EctD蛋白結(jié)構(gòu)得到解析（PDB no.3EMR）[11]。從解析的結(jié)構(gòu)來(lái)看，EctD蛋白以單體形式存在，與其他非血紅素鐵（Ⅱ）和2-酮戊二酸依賴(lài)性雙加氧酶的成員一樣，其蛋白結(jié)構(gòu)的核心部分由雙鏈β-螺旋和一些穩(wěn)定的α-螺旋組成。它由鏈β-Ⅰ、β-Ⅱ、β-Ⅲ、β-Ⅳ、β-Ⅴ、β-Ⅵ、β-Ⅶ和β-Ⅷ組成，其中β-Ⅱ、β-Ⅳ、β-Ⅴ和β-Ⅶ形成曲折的片段，組成所謂的短鏈，而主要片段則由β-I、β-Ⅲ、β-Ⅵ和β-Ⅷ組成。EctD中的主要片段兩側(cè)的延伸由反平行鏈β-2、β-3和β-4組成。

4.1 Fe2+結(jié)合位點(diǎn)

非鐵紅素和2-酮戊二酸依賴(lài)性的雙加氧酶家族的酶促功能主要取決于高度活潑的鐵離子。在需鹽枝芽孢桿菌EctD的活性中心，氨基酸殘基His146、Asp148和His248的功能基團(tuán)（2個(gè)咪唑基團(tuán)和1個(gè)羧基基團(tuán)）與Fe2+結(jié)合形成所謂的2-His-1-羧酸酯面三聯(lián)體[11-18]。Widderich等將這些位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后，不僅導(dǎo)致突變體蛋白H146A、D148A和H248A完全喪失了酶學(xué)活性，而且在突變體蛋白中也不再含有鐵離子，與之相反的是，每摩爾野生型EctD中含有0.9 mol的鐵離子，這些結(jié)果證明氨基酸殘基His146、Asp148和His248是酶蛋白結(jié)合鐵離子及酶活性所必需的[18]。

4.2 2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)

在所有含非還原性亞鐵離子和2-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶中，共底物2-酮戊二酸結(jié)合于酶蛋白活性中心底部，并通過(guò)其1-羧基基團(tuán)和2-氧代基團(tuán)參與協(xié)調(diào)亞鐵離子與酶的結(jié)合，其5-羧基基團(tuán)則通過(guò)與精氨酸或賴(lài)氨酸的側(cè)鏈堿性基團(tuán)形成的鹽橋及與氨基酸殘基的羥基形成氫鍵而穩(wěn)定結(jié)合[18-19]。

由于至今還沒(méi)有得到EctD與2-酮戊二酸的復(fù)合物晶體，2-酮戊二酸與EctD的結(jié)合位點(diǎn)只能通過(guò)比較EctD的配體結(jié)合口袋及其他雙加氧酶的結(jié)構(gòu)來(lái)推測(cè)。McDonough等對(duì)與EctD最接近的PhyH蛋白結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，Ser266的羥基基團(tuán)與2-酮戊二酸相互作用[20]；通過(guò)對(duì)71個(gè)EctD類(lèi)蛋白序列比對(duì)，Ruter等發(fā)現(xiàn)需鹽枝芽孢桿菌來(lái)源的EctD中Ser250位點(diǎn)與PhyH中Ser266位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，該位點(diǎn)嚴(yán)格保守，位于與亞鐵離子螯合的His248之后，Ruter等推測(cè)EctD中Ser250的醇羥基可能與2-酮戊二酸的5-羧基基團(tuán)相互作用[11]。隨后，Widderich等通過(guò)對(duì)185個(gè)EctD類(lèi)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)及PhyHD1A（PDB no.2OPW）和2-酮戊二酸復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)EctD中氨基酸位點(diǎn)Arg259、Ser250和Phe143與PhyHD1A中2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，將這些位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后均導(dǎo)致酶蛋白活性喪失，說(shuō)明EctD中2-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)由 Arg259、Ser250和 Phe143構(gòu)成[18]。此外，Wid?derich等發(fā)現(xiàn)，除了上述與2-酮戊二酸結(jié)合的3個(gè)位點(diǎn)外，Arg131也和2-酮戊二酸分子存在相互作用，其側(cè)鏈與Phe95及Asn133的側(cè)鏈形成陽(yáng)離子-π相互作用，從而使其穩(wěn)定存在于結(jié)合配體的孔穴之中，起到了維持EctD結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用，一旦失去了這個(gè)相互作用就會(huì)導(dǎo)致EctD活性中心更加開(kāi)放，導(dǎo)致酶蛋白不能結(jié)合底物。Widderich等將上述3個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別突變?yōu)锳la后，所得突變體蛋白完全喪失了活性，證明這些位點(diǎn)和2-酮戊二酸之間存在相互作用[18]。因此，可以說(shuō)EctD中2-酮戊二酸的結(jié)合位點(diǎn)由Arg259、Ser250、Phe143、Arg131、Asn133和 Phe95構(gòu)成。

4.3 四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)

同樣，由于至今還沒(méi)有得到EctD與底物（四氫嘧啶）或產(chǎn)物（5-羥化四氫嘧啶）的復(fù)合物晶體，底物和EctD的結(jié)合位點(diǎn)尚無(wú)法確定[11]。Widderich等通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)（molecular dynamics simula?tions）對(duì)需鹽枝芽孢桿菌來(lái)源的EctD分析發(fā)現(xiàn)，四氫嘧啶位于由氨基酸殘基 Gln129、Trp152、Ser165、Phe242和Phe263組成的口袋中，其與各氨基酸殘基側(cè)鏈間的距離為5～6 ?；此外，四氫嘧啶的甲基基團(tuán)指向位于口袋底部的Ser130的主鏈（甲基基團(tuán)與Ser130的Cα間的距離小于5 ?），其羧基基團(tuán)和Ser165的側(cè)鏈形成氫鍵（二者間距離小于3.2 ?），并導(dǎo)致四氫嘧啶分子的脒基和殘基Gln129側(cè)鏈以氫鍵結(jié)合；而從185個(gè)EctD類(lèi)蛋白序列比對(duì)結(jié)果可以看出，上述6個(gè)氨基酸位點(diǎn)均高度保守。因此，Widderich等推測(cè)這些氨基酸殘基可能是酶蛋白EctD的底物結(jié)合位點(diǎn)[18]。

為了證實(shí)四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果，Widd?erich等構(gòu)建了一系列定點(diǎn)突變體：將氨基酸殘基Gln129、Trp152、Phe242和 Phe263分別突變?yōu)?Ala，所獲得的突變體酶蛋白的活性均完全喪失，而Ser165突變?yōu)锳la僅使酶蛋白的活性功能受到較大程度的限制；進(jìn)一步將Trp152突變?yōu)镻he或Tyr后，突變體同樣失去了蛋白活性，這個(gè)結(jié)果和通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬所構(gòu)建的模型相一致，說(shuō)明四氫嘧啶分子與Trp152側(cè)鏈上的苯環(huán)相互作用，氨基酸置換使該位點(diǎn)側(cè)鏈?zhǔn)ケ江h(huán)后導(dǎo)致突變體蛋白無(wú)法和四氫嘧啶結(jié)合，從而使蛋白喪失活性。同樣，將Phe242和Phe263突變?yōu)門(mén)yr后導(dǎo)致突變體酶蛋白活性大幅下降，而突變?yōu)門(mén)rp后則活性完全喪失，說(shuō)明四氫嘧啶結(jié)合位點(diǎn)不能進(jìn)行較大的結(jié)構(gòu)上的修改，尤其是插入含有大體積側(cè)鏈的色氨酸殘基。Widderich等還對(duì)一些側(cè)鏈遠(yuǎn)離酶蛋白催化中心或伸向cupin桶狀結(jié)構(gòu)但并不與配體相互作用的氨基酸殘基進(jìn)行突變，如位于柔性loop區(qū)域的Pro198和Ser205等，這些位點(diǎn)突變后突變體酶蛋白仍然保持活性。由此可以說(shuō)明氨基酸殘基Gln129、Ser130、Ser165、Trp152、Phe242及 Phe263是與底物四氫嘧啶相結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)[18]。

5 展望

EctD的催化產(chǎn)物5-羥化四氫嘧啶作為相容性物質(zhì)已受到廣泛關(guān)注，它存在于很多細(xì)菌中，提高細(xì)胞內(nèi)的水活度，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡，保證細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)[16]。Rodríguez-Moya等將需鹽色鹽桿菌四氫嘧啶合成基因簇ectABC和ectD串聯(lián)表達(dá)，提高了5-羥化四氫嘧啶的生成量，細(xì)胞對(duì)許多環(huán)境刺激因素（高鹽、溫度、鐵離子、外部滲透劑、DNA促旋酶抑制劑萘啶酸等）的耐受性也得到了提高[21]。目前，利用EctD轉(zhuǎn)化生成5-羥化四氫嘧啶也受到科研工作者的重視。Eilert等將伸長(zhǎng)鹽單胞菌（Halomonas elongata）中5-羥化四氫嘧啶合成基因簇ectA、ectB、ectC和ectD插入漢遜酵母（Hansenula polymorpha）基因組后，所構(gòu)建工程菌株的5-羥化四氫嘧啶轉(zhuǎn)化率接近100%，發(fā)酵液中產(chǎn)物達(dá)到2.8 g/L[22]?？梢钥闯?，目前在EctD的開(kāi)發(fā)利用方面得到了比較充分的研究。不過(guò)，有關(guān)該酶的空間結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理方面的研究還比較少，迄今僅有來(lái)自需鹽枝芽孢桿菌的EctD晶體結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理得到了解析和研究，這方面的工作還有待進(jìn)一步完善。此外，可通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將ectD基因插入工程菌株或轉(zhuǎn)基因植物中，以提高工程菌株和轉(zhuǎn)基因植物對(duì)高鹽、高溫、干燥、冰凍等環(huán)境刺激因素的耐受性。

EctD和脯氨酸羥化酶都屬于Fe2+、2-酮戊二酸依賴(lài)型雙加氧酶超家族，相互間序列同源性較高，與底物及配體的結(jié)合位點(diǎn)高度保守，Widderich等將脯氨酸羥化酶歸類(lèi)于EctD類(lèi)酶蛋白[18]，因此，我們推測(cè)二者或許具有相似的催化功能。由于羥脯氨酸可作為各種軟組織疾病的藥物，還可加快傷口愈合，治療各種皮膚疾病，它還是合成多種藥物的原料，如第三代抗生素，抗腫瘤、抗高血壓及新型胃藥等，因此，羥脯氨酸的生物合成具有廣闊的發(fā)展前景[23-24]。但是，由于當(dāng)前采用的脯氨酸羥化酶主要來(lái)自指囊孢菌，該酶基因中的GC含量過(guò)高（73.9%），影響酶蛋白的可溶性表達(dá)，且該酶的催化活性低，反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)率較低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)[23]。本實(shí)驗(yàn)室從鹽湖樣品中克隆獲得了一個(gè)ectD基因，所編碼酶蛋白以可溶性形式大量表達(dá)，活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該酶具有微弱的羥脯氨酸轉(zhuǎn)化能力；參照已解析的EctD和脯氨酸羥化酶三維結(jié)構(gòu)信息，分析酶蛋白的活性中心及配體結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)基因工程技術(shù)合理改造EctD，以獲得可溶性好且對(duì)脯氨酸催化效率高的理想酶蛋白。

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