大黃魚溶藻弧菌病組織中巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子的檢測(cè)及意義

桑本紅，徐曉津＊，毛勇，王軍，蘇永全

（1.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 福建省海洋漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361021；2.廈門大學(xué) 海洋與地球?qū)W院，福建 廈門361005）

1 引言

大黃魚Lari michthyscrocea是我國主要海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一，是我國養(yǎng)殖規(guī)模最大的海水魚類和我國八大優(yōu)勢(shì)出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一［1］。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，各種傳染性疾病發(fā)生日益頻繁，嚴(yán)重制約大黃魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，其中由溶藻弧菌Vibrioal ginol yticus引起的弧菌病是養(yǎng)殖大黃魚最常見的傳染性疾病之一，其發(fā)病率和死亡率高，給大黃魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）是一種哺乳動(dòng)物宿主炎癥反應(yīng)不可缺少的組成成分［3］，能抑制巨噬細(xì)胞移動(dòng)。Ber nhagen等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)垂體前葉細(xì)胞暴露于內(nèi)毒素脂多糖（LPS）后，就會(huì)釋放 MIF分子，表明MIF是聯(lián)系內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的中介因子［4］。近年來，許多研究證明MIF在細(xì)胞增殖的調(diào)控、細(xì)胞凋亡以及生長(zhǎng)因子的表達(dá)、惡性腫瘤的演進(jìn)等方面起著重要的作用［5］。MIF還參與哺乳動(dòng)物很多急性、慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)病機(jī)制，包括敗血癥、關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎、炎性腸炎和特異性皮炎等［6］。但是MIF的過度表達(dá)，會(huì)引起免疫系統(tǒng)功能紊亂，出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)綜合癥。

國內(nèi)外學(xué)者對(duì)人與動(dòng)物的 MIF研究較多［7－8］，而魚類MIF的研究主要是關(guān)于大黃魚、斑馬魚、紅鰭東方鲀、黃鰭金槍魚等MIF基因的研究［9－12］，對(duì)MIF與魚炎癥關(guān)系的報(bào)道較少［7］。而已有研究表明，MIF在人及動(dòng)物炎癥疾病組織中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過正常組織［13］，MIF存在于多種器官的正常組織中，并參與多種疾病的病理形成過程，如動(dòng)脈粥樣硬化、急性呼吸窘迫綜合癥及潰瘍性結(jié)腸炎等炎癥性疾?。?4］。說明MIF與炎癥疾病的發(fā)病機(jī)制有著密切的關(guān)系。本文采用免疫組化染色方法檢測(cè)MIF在大黃魚溶藻弧菌病組織和健康魚正常組織中的表達(dá)，探討其表達(dá)水平與病理特征的關(guān)系，為其應(yīng)用于大黃魚弧菌病的預(yù)后判斷提供依據(jù)。對(duì)進(jìn)一步尋找有效的預(yù)防、診斷和治療方法均具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 材料

在福建省寧德市海鷗公司的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖場(chǎng)，取體質(zhì)量約350～450 g的健康大黃魚200尾，分2組暫養(yǎng)于養(yǎng)殖池，每組100尾。每天換水1次，投餌2次，水溫24～25℃，暫養(yǎng)1周無異常后開始實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)菌株溶藻弧菌分離自患病大黃魚，經(jīng)回歸感染證明具有較強(qiáng)毒力［2］，于本實(shí)驗(yàn)室－80℃保存。?。?0℃保存菌株接種于含2%NaCl的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，28℃過夜培養(yǎng)，用滅菌生理鹽水洗脫菌苔，稀釋至2×107CFU／mL后用于感染實(shí)驗(yàn)。大黃魚感染前用丁香酚麻醉，感染組每尾腹腔注射菌懸液0.2 mL，對(duì)照組每尾注射滅菌生理鹽水0.2 mL。感染7 d后分別從感染組取有典型病癥的大黃魚和從對(duì)照組隨機(jī)取大黃魚各6尾，取脾、肝、頭腎、腸組織，用10%甲醛溶液固定24 h。石蠟包埋，切片厚度為4μm。

2.2 方法

采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶（S－P）法。大黃魚MIF多克隆抗體（由廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院實(shí)驗(yàn)室提供）［13］，MIF一抗的稀釋濃度為1∶200。染色試劑盒SP－9001、濃縮性DAB試劑盒、兔超免二步法試劑為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。免疫組織化學(xué)染色方法見參考文獻(xiàn)［17］，操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。常規(guī)脫蠟、水化，滴加5 ml 3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下10 min；PBS沖洗，5 min×3次；0.5%BSA封閉1 h，滴加一抗（MIF），4℃，過夜，PBS沖洗，5 min×3次；滴加二抗，37℃孵育20 min；DAB顯色，10 min，室溫；PBS沖洗，5 min×3次；蘇木素復(fù)染，5 min，水沖洗；鹽酸酒精分化，水沖洗，酒精梯度脫水、二甲苯透明后，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。用已知陽性的溶藻弧菌病大黃魚組織作為MIF的陽性對(duì)照。

2.3 結(jié)果判斷

MIF陽性細(xì)胞主要定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色染色為陽性細(xì)胞。每張切片高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野共紀(jì)錄1 000個(gè)細(xì)胞，以染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞數(shù)百分比綜合計(jì)分作半定量分析［4］。（1）按切片中細(xì)胞著色深淺評(píng)分：0分為細(xì)胞無顯色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。（2）按陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的百分比評(píng)分：0%～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野均進(jìn)行陽性細(xì)胞百分比計(jì)分與染色強(qiáng)度計(jì)分，再按這（1）、（2）兩項(xiàng)指標(biāo)的積分相加將結(jié)果分為4級(jí)：0分為陰性（－），1～2分為弱陽性（＋），3～4分為中度陽性（＋＋），5～7分強(qiáng)陽性（＋＋＋）。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用四格表χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 MIF在溶藻弧菌病大黃魚組織中的表達(dá)

3.1.1 MIF在溶藻弧菌病大黃魚腸組織中的表達(dá)

MIF在健康大黃魚大腸組織中表達(dá)陰性（見圖1a）。感染溶藻弧菌患病大黃魚腸絨毛呈不整齊、模糊不清、崩解，腸壁黏膜下層及肌肉層結(jié)構(gòu)松散，出現(xiàn)許多空泡。MIF在患病大黃魚腸組織呈陽性表達(dá)，MIF在腸固有層、黏膜層與黏膜下層著色較強(qiáng)，棕黃色細(xì)顆粒較多（見圖1b、1c）。

3.1.2 MIF在溶藻弧菌病大黃魚脾組織中的表達(dá)

健康大黃魚脾組織MIF無表達(dá)（見圖1d）。感染溶藻弧菌患病大黃魚脾竇和脾索不清晰，分界不明顯，MIF在患病大黃魚脾組織中陽性表達(dá)，呈灶狀或彌漫性分布，以細(xì)胞質(zhì)為主，部分為胞膜著色，為棕黃色顆粒，陽性細(xì)胞在脾組織中的分布不均勻（見圖1e）。

3.1.3 MIF在溶藻弧菌病大黃魚頭腎組織中的表達(dá)

大黃魚頭腎無被膜，外周僅有一層膠原纖維包裹。頭腎實(shí)質(zhì)中無腎單位，屬于網(wǎng)狀淋巴組織。MIF在健康大黃魚大腸組織中不表達(dá)（見圖1f）。感染溶藻弧菌后，頭腎出現(xiàn)較多空泡。組織中可見大量的陽性細(xì)胞，而且染色強(qiáng)度為黃色至棕褐色，呈強(qiáng)陽性高表達(dá)（見圖1g、1h）。

3.2 大黃魚溶藻弧菌病各免疫器官M(fèi)IF免疫組織化學(xué)比較研究

MIF在健康大黃魚頭腎、脾、腸各組織中均無表

達(dá)；MIF在感染溶藻弧菌患病大黃魚腸表達(dá)強(qiáng)陽性為49%，陽性率為56%（表1）。MIF在患病大黃魚脾表達(dá)強(qiáng)陽性為41%，陽性率為64%（表2）。MIF在患病大黃魚頭腎表達(dá)強(qiáng)陽性為89%，陽性率為92%（表3）。說明MIF在病魚頭腎中強(qiáng)陽性表達(dá)率最高，MIF在溶藻弧菌病大黃魚表達(dá)強(qiáng)度從弱到強(qiáng)依次是腸、脾、頭腎（表1、2、3）。

圖1 MIF在大黃魚各組織中的表達(dá)Fig.1 MIF immunohistochemistry in the healthy tissues and diseased tissues of Lari michthys crocea challenged with Vibrio al ginol yticus

表1 MIF在健康大黃魚與溶藻弧菌病大黃魚腸中的表達(dá)Tab.1 Synopsis of MIF reactivity in the intestines of Larimichthys crocea bet ween healthy and diseased fish

表2 MIF在健康大黃魚與溶藻弧菌病大黃魚脾中的表達(dá)Tab.2 Synopsis of MIF reactivity in the spleen of Larimichthys crocea bet ween healthy and diseased fish

表3 MIF在健康大黃魚與溶藻弧菌病大黃魚頭腎中的表達(dá)Tab.3 Synopsis of MIF reactivity in the head kidney of Larimichthys crocea between healthy and diseased fish

4 討論

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）來源于垂體前葉［15］、外周的單核與巨噬細(xì)胞［16］，是一種含有115個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，并且受下丘腦垂體控制的多功能性細(xì)胞因子。MIF作用較為廣泛，是炎癥介質(zhì)，MIF將巨噬細(xì)胞限制在異位灶處，并增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的分泌功能，能限制巨噬細(xì)胞在炎癥區(qū)域的移動(dòng)，也能激活巨噬細(xì)胞，使其通過自身分泌和旁分泌作用分泌多種細(xì)胞因子，包括TNF－α、IL－1等，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)激活和趨化更多的巨噬細(xì)胞聚集［17］，增強(qiáng)其黏附、吞噬和抗腫瘤作用，又具有抑制巨噬細(xì)胞移動(dòng)的特性，是重要的促炎癥反應(yīng)介質(zhì)，在多種炎癥與自身免疫反應(yīng)性疾病起著很重要的作用。MIF參與多種生理生化過程，如：炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、血管生成以及腫瘤形成等過程。在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起重要作用［18］。

近年大黃魚炎癥疾病發(fā)病率增高，MIF與魚類炎癥疾病的關(guān)系如何，迄今未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以免疫組化法檢測(cè)MIF在溶藻弧菌病大黃魚頭腎、脾、腸等組織中的表達(dá)，結(jié)果表明MIF在健康對(duì)照組大黃魚組織中無表達(dá)；MIF在患病大黃魚頭腎、脾、腸強(qiáng)陽性表達(dá)分別為89%、41%、49%，提示MIF與魚炎癥疾病有關(guān)。目前有關(guān)MIF的研究主要集中在人與動(dòng)物的惡性腫瘤方面［19－20］，對(duì)許多細(xì)胞分子的研究表明，MIF作為在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用的細(xì)胞因子，在胃炎、胃癌的發(fā)生發(fā)展中起了很重要的作用［21］。而一些體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，幽門螺桿菌能誘導(dǎo)MIF表達(dá)增強(qiáng)，幽門螺桿菌陽性的胃黏膜上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞MIF表達(dá)陽性顯著高于幽門螺桿菌陰性者，單核細(xì)胞與幽門螺桿菌共同培養(yǎng)后單核細(xì)胞表達(dá)MIF陽性顯著增加，幽門螺桿菌感染與胃上皮及炎癥細(xì)胞MIF蛋白表達(dá)有關(guān)［21］，本研究結(jié)果中頭腎與脾作為大黃魚免疫器官，含有單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞，MIF在溶藻弧菌病大黃魚免疫器官頭腎與脾中陽性表達(dá)率較高，高于在患病大黃魚中腸的表達(dá)，尤其在病魚頭腎中MIF陽性表達(dá)92%。MIF在患病大黃魚腸表達(dá)強(qiáng)度陽性率為56%，MIF在溶藻弧菌病大黃魚組織中表達(dá)強(qiáng)度從弱到強(qiáng)依次是腸、脾、頭腎。而健康大黃魚組織MIF表達(dá)陰性，同樣說明溶藻弧菌感染與魚炎癥細(xì)胞MIF蛋白表達(dá)有關(guān)。

而BESWICK等體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)幽門螺桿菌能通過Cag A刺激胃黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生MIF，促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞增殖，而用抗MIF抗體能阻滯胃上皮細(xì)胞增殖，提示MIF在幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃上皮細(xì)胞增殖中可能扮演重要的作用［22］。于曉輝等研究40例人胃癌組織中MIF陽性表達(dá)例數(shù)明顯高于正常胃黏膜［23］。與這些人與動(dòng)物疾病組織中MIF表達(dá)研究報(bào)道相似，本研究結(jié)果表明MIF在健康大黃魚組織中無表達(dá)，在溶藻弧菌病大黃魚頭腎、脾、腸等組織病變中高表達(dá)。顯示MIF在大黃魚溶藻弧菌病發(fā)病中發(fā)揮某種重要作用，但具體的發(fā)病調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)行進(jìn)一步的研究和探討，而深入了解其作用機(jī)制可能為魚類炎癥疾病治療開辟新的途徑。

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