基于PLS ／ANN-RP-HPLC的甲基苯甲醛同分異構體的同時測定

張 匯，李彥威，張照昱

（太原理工大學 化學化工學院，太原 030024）

化學計量學是化學的一門分支學科，它運用數(shù)學、統(tǒng)計學及計算科學，設計和選擇最佳實驗方法，并通過解析化學測量數(shù)據(jù)，獲得最大限度的化學信息[1]。近年來，化學計量學中的許多方法已被廣泛應用于色譜分析中，如偏最小二乘法（Partial Least Squares，PLS）、人工神經網絡（Artificial Neural Network，ANN）、信號處理、因子分析等，成功地解決了色譜峰型重疊、基線漂移等問題，并將其應用于藥物識別、食品原料分類等領域[2-4]。本文將PLS和ANN分別與反相高效液相色譜法（RP-HPLC）相結合，建立了同時測定鄰、間、對甲基苯甲醛同分異構體的預測模型，研究了同時測定三組分的適宜條件和適用范圍，并將所建立的模型用于合成樣品的分析，獲得了良好的實驗結果，為有機化合物同分異構體的測定提供了一種新的途徑。

1 算法原理

1.1 偏最小二乘法[1]

PLS是一種基于因子分析的多變量校正方法，它同時對測量數(shù)據(jù)矩陣和濃度矩陣進行主成分分解，將所得主成分數(shù)代入偏最小二乘法，并通過迭代的方法，交換迭代變量，將兩個獨立的主成分分析過程聯(lián)系起來，對測量矩陣進行校正，利用校正后的測量矩陣預測未知樣品的含量。

PLS建立校正模型最困難的問題之一就是如何確立建模所使用的主成分數(shù)目。確定主成分數(shù)的方法，目前最常用的是交互驗證的預測殘差平方和S（prediction residual error sum of squares，PRESS）。其基本原理是將一組已知的標準混合溶液的響應矩陣A中的數(shù)據(jù)分成n個子集，把這n個子集中的一個作預測集，其余（n-1）個作校正集。這樣將n個子集輪流作一次預測集樣品，經n次校正-預測過程，就可用S來估計預測的誤差。S按下式計算：

其中，ρij是第j個組分在i個樣本子集中的真實質量濃度是預測的質量濃度值，m是主成分數(shù)，n為樣品數(shù)。分別取主成分數(shù)m為1，2，…來構造校正模型，并計算各個m值時的S值。因此，根據(jù)S值的大小，可確定主成分數(shù)m的值。

1.2 人工神經網絡[1，5]

ANN是一種模擬人腦功能的新型信息處理系統(tǒng)，具有一定的自適應、自組織、自學習及自動建模功能，對于處理非線性體系有其獨到之處。目前比較成熟的三層BP神經網絡模型，由輸入層、輸出層和隱含層組成，同層各節(jié)點互不連接，相鄰層的節(jié)點通過權連接。輸入層各點的輸入信號經權重耦合到隱含層的各點，由傳遞函數(shù)f（x）轉換后再耦合到輸出層的各點。將輸出信號與學習樣本的目標數(shù)值進行比較，兩者之間的誤差利用“反傳算法”沿原通道返回，通過修改各層節(jié)點的連接權重，使誤差達到最小。其結構如圖1所示。

圖1 BP神經網絡示意圖

ANN可用于高維數(shù)據(jù)的擬合，即在樣本點構成的高維空間，生成一個逼近其變化趨勢（規(guī)律）的超曲面。如果它既能很好地擬合已知樣本，又能很好地預測未知樣本，即稱所建的模型逼近了規(guī)律，是可靠的；若僅精確地逼近已知樣本，但預測未知樣本的能力變差，則產生了過擬合，模型不可靠。將已知樣本分成訓練集和預測集兩部分，將訓練集預測誤差反傳調節(jié)ANN權值，結合預測集預測誤差和訓練集誤差，檢測過擬合及優(yōu)化模型。為此作出如下定義。

1）逼近誤差：

式中：e為逼近誤差；ex為訓練集預測平均相對誤差；ey為預測集預測平均相對誤差；nx為訓練集樣本數(shù)；ny為預測集樣本數(shù)；n為已知樣本數(shù)。

2）逼近度：

式中：D為逼近度；c為常數(shù)。通過調節(jié)c的大小，進而調節(jié)D的大小以便于作圖。逼近度表示模型與規(guī)律的逼近程度，e越小，D越大，模擬越具有更好的預測能力。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

日本島津公司LC-10A型高效液相色譜儀；TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用有限公司）。實驗所用甲醇為色譜純（天津四友），鄰甲基苯甲醛（o-tolualdehyde，質量分數(shù)98%）、間甲基苯甲醛（m-tolualdehyde，質量分數(shù)97%）和對甲基苯甲醛（t-tolualdehyde，質量分數(shù)98%）（A Johnson Matthey Company）均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水，色譜用水為超純水。所有試劑均經0.22μm的濾膜過濾并超聲脫氣后使用。

2.2 色譜條件

Shim-pack VP-ODS 色譜柱（150mm×4.6 mm，（4.6±0.3）μm）（日本島津）；流動相配比為V（甲醇）∶V（水）＝40∶60；流速0.80mL／min；柱溫40℃；檢測波長250nm；進樣量20μL。

2.3 供試液的配制

分別準確稱取鄰、間、對甲基苯甲醛0.0025g于25mL棕色容量瓶中，用純甲醇定溶至刻度，即配制成100.00μg／mL鄰、間、對甲基苯甲醛儲備液。準確移取上述適量的鄰、間、對甲基苯甲醛儲備液于10mL棕色容量瓶中，用純甲醇定容，配制成各自的單組分溶液或一系列三組分混合溶液，待測。

2.4 實驗方法

在指定色譜條件下對供試液進行測定，將得到的單組分及混合組分的色譜數(shù)據(jù)輸入用MATLAB7.0軟件編寫的PLS和ANN程序處理，分別計算混合溶液中各組分的含量。

3 結果與討論

3.1 三種同分異構體混合測定的色譜圖

配制o-T，m-T，p-T質量濃度比為1∶1∶1的混合標準溶液，在2.2所述的色譜條件下進行測定，結果如圖2所示。

由圖可知，此色譜條件下甲基苯甲醛三種同分異構體的色譜峰是難以完全分離的，且均有較大程度的重疊，不能采用常規(guī)色譜法進行定量分析。

3.2 鄰、間、對甲基苯甲醛單組分的線性關系

按照實驗方法，配制一系列濃度不同的鄰、間、對甲基苯甲醛標準溶液，分別在指定色譜條件下進行測定，并進行線性回歸。結果表明，三者質量濃度在1.0～20.0μg／mL范圍內均呈現(xiàn)良好的線性關系，其回歸方程分別為

圖2 三種異構體混合物色譜圖

因此，本實驗中校正集的質量濃度選在該范圍內。

3.3 預測模型的建立

3.3.1 校正集的建立

在初步試驗的基礎上，采用正交試驗方法，選擇三個L16（45）正交表作為校正集，質量濃度范圍分為三個區(qū)間：3.00～6.00μg／mL，7.00～13.00μg／mL，14.00～20.00μg／mL，在指定色譜條件下進行分析測定。

3.3.2 PLS模型的建立

在PLS法中，主成分數(shù)的確定對預測結果的準確性起著至關重要的作用。本實驗采用交互驗證法建立模型，為了避免“過擬合”引入更多的噪聲，通過F檢驗來確定當S達到最小時的主成分，即最佳主成分數(shù)[6]。如圖3所示，當選擇F檢驗的置信度為0.75時，得到鄰、間、對甲基苯甲醛的最佳主成分數(shù)均為5。

圖3 S隨主成分數(shù)變化曲線

3.3.3 ANN模型的建立

根據(jù)已經建立的校正集可以確定，ANN模型的輸入層節(jié)點數(shù)為16、輸出層節(jié)點數(shù)為3，學習速率和動量常數(shù)等其它參數(shù)都采用軟件Matlab7.0神經網絡工具箱的默認值。下面主要討論模型建立過程中最重要的三個參數(shù)如神經元、訓練次數(shù)和目標誤差的選擇。

1）神經元的選擇。

在試樣數(shù)量和輸入節(jié)點數(shù)確定的情況下，神經元個數(shù)的選擇是建模的主要問題。若神經元過少，則網絡中的權重不充分。此時的網絡不能夠較好地描述試樣集的固有規(guī)律，即不能夠得到好的預測數(shù)學模型。相反，若神經元過多，則會發(fā)生過擬合。過擬合時，對于預測集（未參加數(shù)學模型的構造）來說，則誤差可能較大，這就是通常所說的數(shù)學模型的不穩(wěn)定。本實驗通過改變神經元個數(shù)，分別計算訓練集（即校正集）和預測集的預測相對誤差以及逼近度，取逼近度最大的點作為模型的神經元個數(shù)，如圖4所示，本實驗中模型的神經元個數(shù)選為14。

圖4 逼近度隨神經元數(shù)的變化曲線

2）訓練次數(shù)的選擇。

在建模過程中，訓練次數(shù)的選擇也是一個重要問題。訓練次數(shù)過少，訓練不徹底，誤差無法趨近于目標誤差；訓練次數(shù)過大，將導致“過訓練”，即所建立的模型去契合個別試樣，這樣的模型對于訓練集（即校正集）來說誤差較小，但對于“未知”試樣（預測集）來說誤差可能就很大。如圖5所示，本文選擇訓練次數(shù)為450次。

3）目標誤差的選擇。

目標誤差不但影響ANN模型的預測精度，而且對模型的泛化能力有嚴重的影響。本實驗通過計算不同目標誤差所對應模型的逼近度，從而優(yōu)化模型的預測性能。以逼近度、訓練集預測平均相對誤差和預測集預測平均相對誤差分別對目標誤差作圖，結果如圖6所示。由圖可知，目標誤差為0.6時，逼近度最大，故選擇模型的目標誤差為0.6。

圖5 逼近度隨訓練次數(shù)的變化曲線

圖6 逼近度隨目標誤差的變化曲線

3.3.4 模型預測性能的檢驗

為了檢驗所建立模型的預測能力，按照實驗方法分別對所配制的八組模擬樣品作測定。將測得的色譜數(shù)據(jù)分別輸入建立的兩個模型進行計算，以預測集各樣品中三種甲基苯甲醛質量濃度的預測值對實際值作圖并進行線性回歸，方程式見表1。

表1 預測模型回歸方程

由表1可看出，所建立的兩種模型對甲基苯甲醛三種同分異構體的質量濃度均具有良好的同時預測性能，其模型的有關指標見表2。

表2 預測模型的有關指標

3.4 精密度試驗

配制鄰、間、對甲基苯甲醛質量濃度分別為18.00，20.00，19.00μg／mL的標準混合溶液，按照實驗方法平行測定8次。結果顯示PLS和ANN的相對標準偏差分別保持在0.84%～1.20%和0.11%～0.70%之間，表明這兩種模型均具有良好的精密度。

3.5 加標回收率實驗

分別取質量濃度為4.50，3.50，5.50μg／mL的鄰、間、對甲基苯甲醛配制成樣品溶液，同時加入不同含量的三種同分異構體化合物的標準溶液，采用兩種模型進行加標回收率的測定，結果見表3。

由表3可知，本實驗所建立的兩種同時測定甲基苯甲醛三種同分異構體的預測模型回收率均在97.54%～116.77%之間，而相對偏差在±（1.69～15.4）%之間，表明該方法具有良好的準確度。

表3 加標回收率實驗結果

4 結論

高效液相色譜法與化學計量學方法結合，可有效解析色譜重疊峰，解決有機化合物同分異構體同時測定的問題。本實驗將其應用于鄰、間、對甲基苯甲醛的同時測定，通過選擇偏最小二乘法和人工神經網絡法的建模參數(shù)，分別建立了兩種較為完善的預測模型，獲得了令人滿意的結果。通過對兩種模型的精密度和加標回收率實驗的結果進行比較，發(fā)現(xiàn)人工神經網絡法在處理多組分同時測定的問題方面更顯示出優(yōu)越性。

[1]許祿.化學計量學——一些重要方法的原理及應用[M].北京：科學出版社，2004：2-100.

[2]SarbuC，Nascu-Briciu R D，Kot-Wasik A，et al.Chromatographic lipophilicity determination using large volume injections of the solvents non-miscible with the mobile phase[J].Food Chemistry，2012，130：994-1002.

[3]Weldegergis B T，de Villiers A，Crouch A M.Chemometric investigation of the Volatile content of young South African wines[J].Food Chemistry，2011，128：1100-1109.

[4]Dumarey M，Put R，Van Gyseghem E，et al.Dissimilar or orthogonal reversed-phase chromatographic systems：A comparison of selection techniques[J].Anal Chim Acta，2008，609：223-234.

[5]劉平，梁逸曾，張林，等.人工神經網絡用于化學數(shù)據(jù)解析的研究（Ⅰ）—逼近規(guī)律與過擬合[J].高等學?；瘜W學報，1996，17（6）：861-865.

[6]李彥威，方慧文，梁素霞，等.偏最小二乘紫外分光光度法同時測定丁烯二酸的順反異構體[J].分析化學，2008，36（1）：95-98.