雙功能促胰島素水蛭素（5rolGLP－HV）的構(gòu)建及功能分析

張耀方，馬百成，屠培培，李 寵，馬志華，姬艷麗，董 震，馬 超，郝軍鳳，李曉丹，王 宇，李明剛

（1.南開大學 生命科學學院，分子生物學研究所，生物活性材料教育部重點實驗室，天津300071；2.天津農(nóng)學院，天津300384）

胰高血糖樣多肽1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）是由腸道L細胞合成與分泌的30個氨基酸組成的多肽.研究表明，GLP－1具有顯著增強葡萄糖依賴性的胰島素分泌、減少食物攝取、減慢胃排空、抑制胰高血糖素分泌、刺激胰腺β細胞增殖、促進胰島再生和抑制胰腺β細胞凋亡等作用［1－5］.目前，GLP－1及其相關(guān)新藥的研發(fā)已引起人們廣泛關(guān)注［6］.

水蛭素（hirudin）是從醫(yī)蛭（hirudomedieinalis）唾液腺中分離提純的一種酸性小分子蛋白質(zhì)，一般由65或66個氨基酸組成，分子量約為7 000.水蛭素可預(yù)防深靜脈血栓的形成［7－8］、急性冠脈綜合癥、心肌梗死［8－9］以及肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥等［10］，可有效對抗腦出血損傷［11］并抑制腫瘤細胞的增殖［12］.由于水蛭素分子穩(wěn)定性極高，能耐受酸堿變化、高溫及各種蛋白酶的降解作用，因此可作為口服抗栓劑［7］.目前重組水蛭素在臨床上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用.

人體內(nèi)存在的二肽酶Ⅳ（DPP－Ⅳ）可特異性識別GLP－1肽鏈N端第2位的Pro或Ala殘基，若在肽鏈的N端切除這兩個氨基酸，則GLP－1在體內(nèi)很快被降解為無生物活性的GLP－1（9－36）－NH2和GLP－1（9－37）［13－15］，其生物半衰期約為2min［16］，限制了其在臨床上的應(yīng)用.本文克隆了抗 DPP－Ⅳ和胰蛋白酶降解的GLP－1類似物，命名為重組口服長效促胰島素（recombinant oral long－acting GLP－1，rolGLP－1），并采用融合表達技術(shù)將改進后的5個拷貝重組口服長效rolGLP－1與rHV基因串聯(lián)，得到了能防治糖尿病及其血栓并發(fā)癥的口服長效促胰島素水蛭素（5rolGLP－HV）.

1 材料與試劑

1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、pET22b（＋）及pMD18－T（含有rolGLP－1片段或rolGLP－HV 片段）均由南開大學生物技術(shù)與新藥實驗室保存；rolGLP－1蛋白由南開大學生物技術(shù)與新藥實驗室提供.

1.2 試劑和酶

限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶和5′磷酸化酶均購自日本TaKaRa公司；pfuDNA聚合酶購自北京鼎國生物工程有限公司；鏈脲佐菌素（STZ）購自美國Sigma公司；卡拉膠購自廣東肇慶海星食品工業(yè)有限公司；Ni－NTA購自瑞典Pharmacia公司；引物由上海生物工程有限公司合成，引物設(shè)計列于表1.

表1 引物設(shè)計Table 1 Prime design

2 實驗方法

2.1 pET22b（＋）－5rolGLP－HV 的構(gòu)建

5rolGLP－HV基因構(gòu)建過程如圖1所示.將rolGLP－1上游、rolGLP－1下游和rolGLP－rHV上游引物磷酸化，分別命名為P－rolGLP－1上游，P－rolGLP－1下游和P－rolGLP－HV；以P－rolGLP－1上游和rolGLP－1下 游 為 引物，pMD18－T－rolGLP－1 為 模 板 擴 增 P－rolGLP－1；以rolGLP－1 上 游 和P－rolGLP－1下游為引物，pMD18－T－rolGLP－1為模板擴增rolGLP－1－P；T4連接酶將rolGLP－1－P和P－rolGLP－1連接，分別以5rolGLP－1上游和P－rolGLP－1下游為引物，以連接液為模板擴增2rolGLP－1－P；以P－rolGLP－1上游和XbaⅠ－rHV下游為引物，以pMD18－T－rolGLP－HV 為模板擴增P－rolGLP－HV；T4 連 接 酶 將 2rolGLP－1－P 和 P－rolGLP－HV 連 接， 以 P－rolGLP－1 上 游 和XbaⅠ－rHV下游為引物，連接液為模板擴增 P－3rolGLP－HV；T4連接酶將2rolGLP－1－P 和P－3rolGLP－HV 連接， 以 5rolGLP－1 上 游 和XbaⅠ－rHV下游為引物，擴增5rolGLP－HV；分別以5rolGLP－HV－His上游和5rolGLP－HV－His下游為引物，以5rolGLP－HV 為模板擴增5rolGLPHV－6 His.

將5rolGLP－HV－His基因片段和pET22b（＋）載體分別以KpnⅠ和HindⅢ酶切后T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對鑒定為陽性的質(zhì)粒測序.陽性質(zhì)粒命名為pET22b（＋）－5rolGLP－HV.

圖1 pET－22b（＋）－5rolGLP－HV 的構(gòu)建過程Fig.1 Schematic illustration of pET－22b（＋）－5rolGLP－HVconstruction

2.2 5rolGLP－HV的表達和純化

2.2.1 5rolGLP－HV的表達 將測序正確的重組質(zhì)粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基（含100mg／L氨芐青霉素）中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜.再將菌液以1∶100接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至A600≈0.8，加入異丙基硫代－β－D 半乳糖苷（IPTG）至其終濃度為0.6mmol／L，37℃振蕩培養(yǎng)4h.4℃離心后收集菌體.誘導(dǎo)前的菌體為對照，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分析.

2.2.2 5rolGLP－HV的Western blot鑒定 先將表達的5rolGLP－HV全菌體經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為12%的SDS－PAGE電泳后，再將蛋白條帶轉(zhuǎn)印至醋酸纖維素膜上，在含50g／L脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液（PBS）中4℃封閉過夜，以小鼠抗人GLP－1為一抗，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠lgG為二抗，進行常規(guī)的Western blot檢測，并用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色.

2.2.3 5rolGLP－HV的純化 將IPTG誘導(dǎo)表達后的菌液4℃離心收集菌體.Tris－HCl緩沖液重懸菌體，超聲破碎，離心，取上清液和沉淀進行SDS－PAGE分析.

先以10倍柱體積的Tris－HCl洗柱，裂解上清液上樣，用10倍柱體積的Tris－HCl平衡柱體，含20mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液（pH＝8.0）洗脫雜蛋白，再用含250mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液（pH＝8.0）洗脫目的蛋白.最后用質(zhì)量分數(shù)為12%SDS－PAGE電泳檢測分析.將目的蛋白透析除鹽，－80℃保存?zhèn)溆?

2.3 5rolGLP－HV對小鼠空腹血糖的影響

將雄性3周齡的C57／BL小鼠（體質(zhì)量（12±1）g）隨機分為兩組.正常組（n＝7）：喂食正常飼料；高脂高糖組：喂食高脂高糖飼料.喂食2個月后，將高脂高糖組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液100mg／kg，4周后，斷尾取血檢測小鼠空腹血糖，血糖值大于11mmol／L的即為造模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠（n＝28）.將造模成功的糖尿病小鼠隨機分為4組（n＝7）進行口服灌胃治療.陰性對照組：灌胃生理鹽水；陽性藥組：灌胃二甲雙胍300mg／kg；5rolGLP－HV實驗組：灌胃16mg／kg的5rolGLPHV蛋白；rolGLP－1組：灌胃16mg／kg的rolGLP－1蛋白.連續(xù)灌胃3周，每隔7d檢測一次空腹血糖值.

2.4 5rolGLP－HV的抗血栓活性檢測

將昆明小鼠隨機分為2組.對照組（n＝5）：背部皮下注射50mg／kg質(zhì)量分數(shù)為3%的卡拉膠溶液，并灌胃質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水；實驗組（n＝5）：背部皮下注射50mg／kg質(zhì)量分數(shù)為3%的卡拉膠溶液，并灌胃16mg／kg的5rolGLP－HV.觀察小鼠尾部血栓形成的時間及長度.

3 結(jié)果與分析

3.1 pET22b（＋）－5rolGLP－HV 的構(gòu)建

重組表達質(zhì)粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV的PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在500～750bp內(nèi)可見特異性DNA片段（圖2（A））；經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切可見約5 400bp的載體片段和約700bp的目的基因片段（圖2（B））.對重組質(zhì)粒pET22b（＋）－5rolGLP－HV進行基因測序，結(jié)果表明，5rolGLP－HV－His堿基序列構(gòu)建正確.

圖2 瓊脂糖凝膠電泳分析5rolGLP－HV－His PCR擴增（A）和pET22b（＋）－5rolGLP－HV 質(zhì)粒酶切鑒定（B）結(jié)果Fig.2 Agar electrophoresis result of 5rolGLP－HVfusion gene amplified by PCR （A）and recombinant plasmid pET22b（＋）－5rolGLP－HVdigested with digestion（B）

3.2 5rolGLP－HV的表達及Western blot鑒定

誘導(dǎo)12h的表達產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為12%的SDS－PAGE分析，在分子量約24 000處可見特異的目的蛋白表達條帶，未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌無此條帶（圖3（A））.誘導(dǎo)后的菌體超聲破碎后沉淀和上清液經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為12%的SDS－PAGE分析，考馬斯亮藍染色后，目的蛋白幾乎全部在上清液中，經(jīng)蛋白電泳分析軟件掃描顯示，在上清液中表達的目的蛋白約占總蛋白的12%（圖3（A））.Western blot鑒定表明，目的蛋白與小鼠抗人的GLP－1單克隆抗體有特異性反應(yīng)（圖3（B））.

圖3 E.coli BL21（DE3）／5rolGLP－HV表達產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)為12%的SDS－PAGE鑒定（A）和 Western blot鑒定（B）結(jié)果Fig.3 12%SDS－PAGE analysis results of the induction products of E.coli BL21（DE3）／5rolGLP－HV（A）and Western blot identification results of 5GLP－HV（B）

菌體破碎后，將上清液流經(jīng)Ni－NTA柱親和層析，在含250mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液中洗下目的蛋白，收集蛋白并進行SDS－PAGE分析，結(jié)果如圖4所示.由圖4可見，在第4泳道存在單一的目的條帶，表明5rolGLP－HV的純度較高.Bradford分析結(jié)果表明，蛋白的產(chǎn)率為25mg／L.

3.3 5rolGLP－HV對小鼠空腹血糖的影響

用STZ誘導(dǎo)的Ⅱ型糖尿病小鼠檢測5rolGLP－HV的降糖活性功能，結(jié)果如圖5所示.由圖5可見，正常組小鼠的血糖值變化較小，約為4.8mmol／L；陰性對照組小鼠血糖3周后由16.31mmol／L上升至20.21mmol／L，上升23.8%（p＜0.01）；陽性藥（二甲雙胍）組小鼠在灌胃第一周血糖下降較快，從16.03mmol／L下降至11.75mmol／L，下降26.7%（p＜0.01），灌胃第二周血糖略有上升，第三周血糖下降至10.82mmol／L，下降32.5%（p＜0.01）；rolGLP－1和5rolGLP－HV灌胃組小鼠在灌胃第一周血糖均下降較快，分別從17.77mmol／L和18.12mmol／L下降至15.07mmol／L和16.03mmol／L，分別下降15.2%（p＜0.01）和11.53%（p＜0.01），灌胃第二周血糖值均呈上升趨勢，但上升較慢，灌胃第三周血糖分別降至14.68mmol／L和14.3mmol／L，分別下降17.39%（p＜0.01）和21.08%（p＜0.01）；灌胃3周后，5rolGLP－HV 灌胃組比rolGLP－1灌胃組的降糖效果好（p＜0.05）.

圖4 純化前后促胰島素水蛭素（5rolGLP－HV）的SDS－PAGE電泳分析結(jié)果Fig.4 SDS－PAGE analysis result of purified 5rolGLP－HV

圖5 5rolGLP－HV對Ⅱ型糖尿病小鼠空腹血糖的影響Fig.5 Effect of 5rolGLP－HV on fasting blood glucose in typeⅡdiabetic mice

3.4 5rolGLP－HV抗血栓效果

本文采用一種無創(chuàng)性小鼠體內(nèi)血栓動物模型研究5rolGLP－HV的抗凝活性，通過觀察其尾部血栓出現(xiàn)的時間及程度（即相對長度）判斷5rolGLP－HV抗血栓效果，結(jié)果如圖6所示.由圖6可見：灌胃生理鹽水的對照組小鼠和5rolGLP－HV組小鼠在分別注射卡拉膠約24h和32h后尾部均出現(xiàn)明顯的血栓；對照組和5rolGLP－HV組小鼠尾部血栓形成的相對長度分別為（55.2±2.1）%和（29.6±2.7）%.

圖6 小鼠尾部血栓形成的測量結(jié)果Fig.6 Results of thromboplastic length of the mice’s tail blood

綜上所述，本文構(gòu)建了E.coli BL21（DE3）pET22b（＋）－5rolGLP－HV工程表達菌株.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)菌體破碎后，目的蛋白在上清液中的表達量約占總蛋白的12%，其上清液經(jīng)Ni－NTA柱親和層析用含250mmol／L咪唑的Tris－HCl緩沖液洗脫即可獲得較高純度的5rolGLP－HV，產(chǎn)率為25mg／L.動物實驗結(jié)果表明，5rolGLP－HV具有較好的降糖和抗血栓效果.

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