三氧化二砷對(duì)支氣管哮喘小鼠Th17細(xì)胞的影響

張 莉，范賢明，王文軍，李 坑，向旭東

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)二科，四川 瀘州 646000）；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院急診科，湖南 長(zhǎng)沙 410011）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種與免疫功能紊亂有關(guān)的慢性氣道炎癥性疾病，其中T細(xì)胞發(fā)揮著重要作用［1］。Th17細(xì)胞是一類(lèi)新的T細(xì)胞亞群，主要通過(guò)分泌IL－17起作用。Th17／IL－17參與了多種炎癥與自身免疫性疾?。?］。近期研究發(fā)現(xiàn)，Th17／IL－17可能在哮喘的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［3，4］。中醫(yī)實(shí)踐表明，三氧化二砷（Arsenic trioxide，ATO）具有良好的平喘作用，但機(jī)制不清楚，且關(guān)于ATO對(duì)哮喘Th17／IL－17的作用亦未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立哮喘小鼠模型，觀察ATO對(duì)哮喘小鼠的作用，尤其是對(duì)Th17細(xì)胞和IL－17的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 卵白蛋白（OVA，V級(jí)）、氫氧化鋁凝膠、ATO（美國(guó)Sigma公司）；淋巴細(xì)胞分離液（中國(guó)達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；T細(xì)胞磁珠分離試劑盒、LS分離柱、Midi MACS磁珠分選器（德國(guó) Milte－nyi公司）；FITC抗鼠IL－17A、固定劑、破膜劑（美國(guó)Biolegend公 司）；IL－4、IL－17ELISA 試 劑 盒 （美 國(guó)R＆D公司）。

1.2 動(dòng)物分組及模型復(fù)制 30只SPF級(jí)雌性BALB／c小鼠，6～8周齡，體重（18～22）g，隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組、ATO組，每組10只。哮喘組及ATO組于第1、13天腹腔注射致敏劑0.2ml（含OVA 10 μg和氫氧化鋁凝膠2mg），19天起以5%OVA霧化激發(fā)，每天30min，連續(xù)6天。ATO組每次激發(fā)前30 min腹腔注射2.5mg／kg ATO 0.2ml，哮喘組以等量PBS代替。對(duì)照組致敏激發(fā)用PBS代替。

1.3 小鼠處理及標(biāo)本制備 末次激發(fā)24小時(shí)后，Buxco系統(tǒng)測(cè)量氣道對(duì)乙酰甲膽堿（Mch）的肺阻力。收集左肺支氣管肺泡灌洗液（BALF），細(xì)胞瑞士染色后分類(lèi)計(jì)數(shù)。碾磨脾臟，淋巴細(xì)胞分離液制備脾單個(gè)核細(xì)胞懸液，免疫磁珠陽(yáng)性分選T細(xì)胞。

1.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子濃度 BALF及培養(yǎng)上清液中IL－17、IL－4測(cè)定采用ELISA法，參照試劑盒說(shuō)明操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。簡(jiǎn)單直線相關(guān)性分析探討兩因素之間相關(guān)關(guān)系。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi) 與對(duì)照組相比，哮喘組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞顯著增加（均P＜0.01）；與哮喘組相比，ATO組上述細(xì)胞數(shù)顯著減少（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 肺阻力檢測(cè) 與對(duì)照組相比，哮喘組隨著 Mch劑量遞增表現(xiàn)出更顯著的氣道阻力；ATO組氣道阻力顯著低于哮喘組，見(jiàn)圖1。

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類(lèi)計(jì)數(shù)（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.01；與哮喘組比較，②P＜0.05

組別 細(xì)胞總數(shù) 嗜酸性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 中性粒細(xì)胞對(duì)照組 6.95±1.220.15±0.060.36±0.190.23±0.09哮喘組 21.11±3.28① 3.10±0.50① 6.60±0.97① 4.92±0.45①ATO組 13.04±2.58② 1.06±0.19② 2.43±0.28② 2.36±0.29②

圖1 各組氣道肺阻力比較Figure 1 Comparison of lung resistance in each group

2.3 Th17細(xì)胞陽(yáng)性率比較 哮喘組脾臟Th17細(xì)胞陽(yáng)性率［（12.2±2.2）%］顯著高于對(duì)照組［（1.4±0.4）%，P＜0.01］；ATO組Th17細(xì)胞陽(yáng)性率［（8.9±1.2）%］顯著低于哮喘組（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 各組脾臟Th17細(xì)胞陽(yáng)性率比較Figure 2 Comparison of positive rate of Th17cells

表2 各組脾臟T細(xì)胞總數(shù)及BALF相關(guān)指標(biāo)比較（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

表2 各組脾臟T細(xì)胞總數(shù)及BALF相關(guān)指標(biāo)比較（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與哮喘組比較，②P＜0.05

組別 CD4＋T細(xì)胞（×108／L） IL－17（pg／ml） IL－4（pg／ml）對(duì)照組 6.9±0.8 97.6± 7.6 185.6±21.5哮喘組 17.9±2.1① 169.5± 8.3① 323.5±16.9①ATO組 12.9±2.3② 113.9±11.0② 248.3±19.0②

2.5 培養(yǎng)上清液中IL－17、IL－4濃度 ATO 干預(yù)組培養(yǎng)上清液中IL－17、IL－4濃度［分別為（7.9±1.5）、（42.7±5.0）pg／ml］均顯著低于哮喘原液組［分別為（15.3±2.4）、（71.6±7.0）pg／ml，均P＜0.01］。

2.6 相關(guān)性分析 Th17細(xì)胞陽(yáng)性率與BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)（r＝0.998，P＜0.05），BLAF中IL－17濃度與中性粒細(xì)胞數(shù)呈顯著正相關(guān)（r＝0.982，P＜0.05）。

3 討論

經(jīng)典的“Th1／Th2失衡理論”并不能解釋哮喘的全部：過(guò)繼回輸Th1細(xì)胞可以引起嚴(yán)重的氣道炎癥，Th1型細(xì)胞因子IFN－γ與抗原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性和嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。近期支氣管黏膜活檢發(fā)現(xiàn)，重癥哮喘患者氣道Th17細(xì)胞數(shù)量及其分泌IL－17的功能明顯增加［3］。Th17／IL－17對(duì)中性粒細(xì)胞具有強(qiáng)大的趨化作用，可導(dǎo)致氣道局部炎癥擴(kuò)大或持久存在，介導(dǎo)激素抵抗型哮喘的氣道炎癥和高反應(yīng)性［4］。Th17、IL－17是介導(dǎo)哮喘免疫源性氣道炎癥的重要原因［5］。

既往研究認(rèn)為，小劑量ATO能促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞凋亡、抑制NF－κB表達(dá)；能抑制骨髓嗜酸性粒細(xì)胞生成，降低血清和BALF中IL－5水平。但是關(guān)于ATO對(duì)哮喘T細(xì)胞，尤其是Th17、IL－17的研究未見(jiàn)報(bào)道。Th17細(xì)胞能通過(guò)IL－17介導(dǎo)氣道中性粒細(xì)胞聚集，并可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥［6］。可見(jiàn)與嗜酸性粒細(xì)胞相比，Th17細(xì)胞處于炎癥反應(yīng)上游，對(duì)其進(jìn)行探討更有意義。本實(shí)驗(yàn)中，ATO干預(yù)組小鼠BALF中各類(lèi)炎癥細(xì)胞及氣道肺阻力顯著低于哮喘組，提示ATO能減輕氣道炎癥及高反應(yīng)性。Th2細(xì)胞主要通過(guò)分泌IL－4等Th2型因子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)參與哮喘發(fā)?。?］。我們發(fā)現(xiàn)，ATO組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及IL－4含量均較哮喘組明顯下降；體外實(shí)驗(yàn)同樣顯示T細(xì)胞在ATO干預(yù)后分泌IL－4顯著減少，提示ATO能夠抑制Th2細(xì)胞的功能，減輕氣道嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥。

部分哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感與氣道中性粒細(xì)胞性炎癥有關(guān)，因?yàn)樘瞧べ|(zhì)激素可對(duì)抗中性粒細(xì)胞凋亡［7］。本研究提示ATO能減輕氣道中性粒細(xì)胞性炎癥反應(yīng)。ATO組Th17細(xì)胞陽(yáng)性率、BLAF中IL－17含量均較哮喘組下降，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)ATO能抑制T細(xì)胞分泌IL－17，提示ATO能抑制Th17、IL－17的表達(dá)。Th17／IL－17是介導(dǎo)哮喘氣道中性粒細(xì)胞性炎癥的重要原因［5］。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞陽(yáng)性率、IL－17水平均與BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)，故我們推測(cè)ATO對(duì)哮喘的治療作用除降低Th2效應(yīng)外，還可能與減少Th17、IL－17產(chǎn)生，從而抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥及高反應(yīng)性有關(guān)。

4 結(jié)論

ATO能夠抑制Th17及IL－17的表達(dá)，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)及高反應(yīng)性。ATO可能對(duì)治療糖皮質(zhì)激素不敏感的中性粒細(xì)胞性哮喘有潛在價(jià)值。

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