瑞舒伐他汀抑制小鼠哮喘模型慢性氣道炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究＊

張 維，朱 濤，王導(dǎo)新，鄧 潔，李萬成

（1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川 成都 610000；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院呼吸內(nèi)科，四川 成都 610041；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400010）

支氣管哮喘（bronchial asthma）簡稱哮喘，目前被定義為由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾?。?～3］。慢性持續(xù)的氣道炎癥是哮喘的根本原因［1～3］。雖然GINA指南的廣泛推廣和接受，以及吸入激素（ICS）和長效β2激動(dòng)劑（LABA）的使用使哮喘的臨床控制有所提高，但是哮喘的死亡率和急診住院率并未有明顯改善［1～3］。新的治療藥物的研究仍然是哮喘研究熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)他汀類藥物具有廣泛的抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)作用［4～6］。本研究旨在探討瑞舒伐他汀在慢性哮喘模型中的抗炎作用和治療價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB／C小鼠30只，6～8周齡，體重18～22g（四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購于美國Sigma公司；瑞舒伐他汀購于瑞典阿斯利康公司；TNF－α、IL－4、IL－5和IL－13ELISA試劑盒均購于美國R＆D公司。

1.2 動(dòng)物模型建立 在實(shí)驗(yàn)的第1、7、14天通過腹腔注射10μgOVA和100μgAL（OH）3配制成的溶液致敏。從第15～81天將小鼠置于特制塑料容器內(nèi)，用超聲霧化器噴入5%OVA生理鹽水10ml激發(fā)1小時(shí)。OVA激發(fā)后小鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快及輕度紫紺等哮喘發(fā)作癥狀［2］。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組，即空白對(duì)照組（Control group）、卵清蛋白＋瑞舒伐他?。∣VA＋RUS group）和卵清蛋白組（OVA group），每組10只，分籠飼養(yǎng)。①Control組：注射等量0.9%生理鹽水代替OVA，并吸入0.9%生理鹽水10ml，余同OVA組。②OVA組：按上述方法制備哮喘模型。③OVA＋RUS組：每次激發(fā)前30min皮下注射瑞舒伐他?。?0mg／kg·d），15～81天。在實(shí)驗(yàn)的81天腹腔注射戊巴比妥（50mg／Kg）麻醉小鼠，下腔靜脈放血處死，并將生理鹽水注入右心室沖洗兩次以洗盡肺內(nèi)殘留血液。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞計(jì)數(shù) 末次霧化吸入24小時(shí)后，以1%戊巴比妥鈉（50mg／kg）腹腔注射麻醉后，以靜脈留置導(dǎo)管作氣管插管遙以1、0.8 ml磷酸鹽緩沖液（PBS）分2次作支氣管肺泡灌洗，并收集BALF 1ml。BALF在4°C下以400r／min離心5min，沉渣以100μl PBS液重懸。使用Diff－Quik染色后做細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。下腔靜脈放血處死小鼠，打開胸腔，結(jié)扎右總支氣管于遠(yuǎn)端切下放于10%中性甲醛中保存。

1.4 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細(xì)胞因子水平分析根據(jù)購買公司試劑盒方法對(duì)BLAF中TNF－α、IL－4、IL－5和IL－13水平進(jìn)行分析。

1.5 HE染色和PAS染色 取右下肺組織，常規(guī)制成5μm的石蠟切片，HE染色觀察小鼠肺組織病理改變。PAS染色法檢測(cè)肺組織粘蛋白糖原表達(dá)情況，粘蛋白糖原呈PAS陽性染色，氣道PAS陽性細(xì)胞主要為杯狀細(xì)胞和粘液腺細(xì)胞，其定量分析可代表氣道粘液表達(dá)水平。肺組織PAS染色后，對(duì)每只小鼠隨機(jī)取至少10個(gè)直徑在100～200μm支氣管進(jìn)行PAS陽性細(xì)胞和PAS陰性細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用PAS陽性細(xì)胞／支氣管總細(xì)胞的百分比來表示。切片采用Image－Pro Plus（Media Cybernetics，Silver Spring，Md）圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析［2］。

2 結(jié)果

2.1 BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)水平 OVA致敏和激發(fā)后小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)明顯增加（均P＜0.05），同時(shí)與OVA＋RUS組相比較，OVA組增加更加顯著（均P＜0.05），見表1。

2.2 BALF中細(xì)胞因子水平 OVA致敏和激發(fā)后小鼠BALF中 TNF－α、IL－4、IL－5 和 IL－13水平明顯增加（均P＜0.05），同時(shí)與 OVA＋RUS組相比較，OVA組增加更加顯著（均P＜0.05），見表2。

2.3 小鼠肺組織病理學(xué)變化與氣道粘液分泌 肺組織切片常規(guī)HE染色和PAS染色，光鏡下觀察。空白組小鼠肺組織中小氣道及血管周圍未見炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管柱狀上皮細(xì)胞無增生，無杯狀細(xì)胞增生，基底膜下未見平滑肌增殖，管腔未見狹窄；OVA組小鼠肺組織中小氣道及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞增生明顯，杯狀細(xì)胞明顯增多，粘液分泌增多，基底膜增厚明顯，并見顯著平滑肌增殖；OVA＋RUS組小鼠肺組織中小氣道及血管周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞增生，杯狀細(xì)胞增加，粘液分泌增多，基底膜增厚和平滑肌增殖，但無OVA組顯著。同時(shí)PAS染色發(fā)現(xiàn)，OVA致敏和激發(fā)后小鼠支氣管PAS陽性細(xì)胞數(shù)較空白組明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且與OVA＋RUS組比較，OVA組增加更明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、2，表3。

表1 各組BALF中細(xì)胞水平計(jì)算（×104／ml，n＝10，）Table 1 The cells in BALF

表1 各組BALF中細(xì)胞水平計(jì)算（×104／ml，n＝10，）Table 1 The cells in BALF

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與OVA組比較，P＜0.05

3.2±1.6 0±0 0±0 0.9±0.2 1.5±0.4 OVA＋RUS組 12.4±2.5①② 2.1±0.4①② 1.5±0.4①② 2.2±0.8①② 2.6±0.9①②OVA組 23.4±4.8① 4.2±0.8① 3.1±0.6① 4.1±0.9① 5.1±1.1組別 細(xì)胞總數(shù) 嗜酸性粒細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 巨噬細(xì)胞對(duì)照組①

表2 各組BALF中細(xì)胞因子水平（n＝10，）Table 2 The cytokines in BALF

表2 各組BALF中細(xì)胞因子水平（n＝10，）Table 2 The cytokines in BALF

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與OVA組比較，P＜0.05

組別 IL－4（×102 pg／ml） IL－5（×102 pg／ml） IL－13（×103 pg／ml） TNF－α（×103 pg／ml）1.27±0.25 4.55±0.12 0.82±0.16 1.03±0.13 OVA＋RUS組 1.64±0.37①② 8.24±1.36①② 1.46±0.31①② 1.36±0.24①②OVA組 2.69±0.86① 14.33±2.54① 3.21±0.48① 3.67±0.74對(duì)照組①

圖1 各組小鼠肺組織病理改變（HE染色×400）Figure 1 The pathological changes of lung（HE Staining×400）

圖2 各組小鼠肺組織糖蛋白表達(dá)情況 （PAS染色×400）Figure 2 The glycoprotein in the mice

表3 各組小鼠氣道糖原表達(dá)PAS染色百分?jǐn)?shù)（n＝10，）Table 3 The percent of clycogen and PAS

表3 各組小鼠氣道糖原表達(dá)PAS染色百分?jǐn)?shù)（n＝10，）Table 3 The percent of clycogen and PAS

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05；②與OVA組比較，P＜0.05

組別 PAS染色百分?jǐn)?shù) （×10－2）3.6±2.6 OVA＋RUS組 37.8±7.9①②OVA組 58.4±10.2對(duì)照組①

3 討論

支氣管哮喘（bronchial asthma）簡稱哮喘，目前定義為一種由多種細(xì)胞（包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等）和細(xì)胞組分（包括多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)）參與的慢性氣道炎癥性疾?。?～3］。雖然近些年隨著GINA指南知識(shí)的普及，吸入激素（ICS）和長效β2激動(dòng)劑（LABA）的聯(lián)合應(yīng)用的推廣使哮喘的臨床控制水平有了較大幅度提高，但是慢性哮喘患者的受益卻仍然有限［1～3，7］。目前認(rèn)為慢性哮喘可以引起氣道重構(gòu)（airway remodeling），并導(dǎo)致氣道不完全可逆性狹窄［1～3］。氣道重構(gòu)的主要表現(xiàn)包括氣道上皮細(xì)胞增殖，杯狀上皮細(xì)胞化生，粘液分泌增加，氣道上皮基底膜增厚，基底膜下膠原沉積，氣道平滑肌細(xì)胞（ASM）增生肥大及肺小血管的增殖性改變等［2，8～10］。

他汀類藥物主要通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A（HMG－CoA）還原酶改善機(jī)體的脂肪代謝。但目前的研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物還具有除改善脂代謝以外，還具有抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、凋亡以及抗腫瘤等多種作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些作用與抑制羥甲基戊二酰輔酶A （HMG－CoA）還原酶無明顯的聯(lián)系［4～6，11］。目前研究證實(shí)，他汀類藥物的抗炎作用與抑制核轉(zhuǎn)錄因子－κB（NF－κB）密切相關(guān)［6］。瑞舒伐他汀是他汀類藥物中作用較強(qiáng)的制劑。

我們的實(shí)驗(yàn)中，HE染色提示肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變，包括小氣道及血管周圍有大量炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞增生明顯，杯狀細(xì)胞明顯增加，粘液分泌增多，基底膜增厚明顯和顯著的平滑肌增殖。但與OVA組相比較，OVA＋RUS組病理改變較輕，表明瑞舒伐他汀能夠有效抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。同時(shí)研究認(rèn)為，哮喘相關(guān)的炎癥狀態(tài)可導(dǎo)致氣道柱狀上皮細(xì)胞向杯狀上皮細(xì)胞化生，導(dǎo)致氣道粘液分泌明顯增加［1～3］。氣道粘液過度分泌可以導(dǎo)致氣道不可逆性阻塞，是致死性哮喘和難治性哮喘的重要原因［1～3］。

4 結(jié)論

瑞舒伐他汀可以有效抑制OVA誘導(dǎo)的慢性哮喘導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和氣道粘液分泌，緩解氣道狹窄。但具體的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步探討。

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