萹蓄抑菌活性及化學(xué)成分研究

李曼曼，劉增輝，王海燕，黃紅梅，王莉莉，徐 燕*

1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部和農(nóng)業(yè)部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230036;2安徽省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，合肥 230061

萹蓄為蓼科植物Polygonum aviculare L.的干燥地上部分，夏季葉茂盛時(shí)采收，2010版藥典收載。味苦，性微寒，歸膀胱經(jīng)。利尿通淋，殺蟲，止癢，主治熱淋澀痛，小便短赤，蟲積腹痛，皮膚濕疹，陰癢帶下［1］。萹蓄生于山坡、田野、路旁等處，全國(guó)各地均有分布。民間廣泛用其治療泌尿系統(tǒng)的感染，結(jié)石及腎炎等疾?。?］?，F(xiàn)代藥理研究也證明萹蓄具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化和保肝［3-6］等作用。因此，為了開發(fā)新型植物源殺菌劑和萹蓄資源深入開發(fā)和利用，本實(shí)驗(yàn)研究萹蓄醇提取物乙酸乙酯萃取部位對(duì)五種致病菌(大腸桿菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌)的抑菌作用，并對(duì)該部位的化學(xué)成分進(jìn)行研究，為萹蓄資源的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藥材和菌種

萹蓄于2010年9月采自安徽省大別山地區(qū)金寨縣，經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院劉守金教授鑒定為Polygonum aviculare L.的干燥地上部分，標(biāo)本存放于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物和生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。菌種大腸桿菌(Escherichia coli)、致病性大腸桿菌(enteropathogenic E．coli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、傷寒桿菌(Salmonella typhi)、痢疾桿菌(Shigella dysenteriae)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天然產(chǎn)物室提供。

1.1.2 試劑和藥品

95%乙醇，石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲醇，丙酮(均分析純，天津博迪化工有限公司);GF254高效薄層版、GF254薄層色譜硅膠、100～200目、200～300目柱色譜硅膠(青島海洋化工有限公司);Sephadex LH-20(Pharmacia);聚酰胺粉和聚酰胺-6-薄膜(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，核磁測(cè)試用氘代試劑(DMSO-d6、丙酮、吡啶)為美國(guó)CIL產(chǎn)品;顯色劑為10%硫酸-乙醇。細(xì)菌用營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(西隴化工股份有限公司);鹽酸小檗堿(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司);諾氟沙星(安徽三精萬森制藥有限公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

HQLl50C恒溫?fù)u床(武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司);智能超凈工作臺(tái)(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司W(wǎng)ZM-1型);電熱手提壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司R-201型);電子天平(上海天平儀器廠T6328B型);恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);核磁共振儀(Varian300 MHz核磁共振分析儀器);超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司KQ3200E型)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乙酸乙酯萃取部位的制備和分離純化

萹蓄干燥地上部分10 kg，經(jīng)適當(dāng)粉碎，用10倍量的70%乙醇回流提取3次，每次2.5 h，提取3次，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏約1.5 kg。將浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取液減壓回收得凈膏309 g，取19 g浸膏用DMSO溶解用于抑菌實(shí)驗(yàn)，剩余浸膏經(jīng)硅膠柱層析，CH2Cl2-MeOH(15∶1 ～3∶1)梯度洗脫，合并后得7個(gè)部分 S1-S7。S2部分再經(jīng)硅膠柱層析，CH2Cl2-MeOH(50∶1～3∶1)梯度洗脫，合并后得組分Fr1-Fr6，F(xiàn)r1有晶體析出，抽濾，重結(jié)晶得化合物1(61.6 mg)，F(xiàn)r2有沉淀析出，抽濾得沉淀，再依次經(jīng)Sephadex LH-20 以 CH2Cl2-MeOH(1∶1)洗脫，硅膠柱層析以 CH2Cl2-Acetone-MeOH(1∶1∶1)洗脫，得化合物2(78.7 mg)，F(xiàn)r2經(jīng)硅膠柱層析，以 CH2Cl2-MeOH(70∶1)洗脫得化合物3(5mg)，F(xiàn)r3依次經(jīng)硅膠柱層析以 CH2Cl2-MeOH(20∶1)洗脫，Sephadex LH-20凝膠柱層析以MeOH洗脫得化合物4(27.9 mg);S3經(jīng)硅膠柱以 CH2Cl2-MeOH(15∶1 ～3∶1)梯度洗脫，得組分 Fr7-Fr10，F(xiàn)r9再依次經(jīng)硅膠柱以CH2Cl2-MeOH(7∶1)洗脫、Sephadex LH-20 以 MeOH洗脫、聚酰胺柱以MeOH-H2O(1∶1)洗脫得化合物5(44.6 mg);S4經(jīng)硅膠柱以CH2Cl2-MeOH(20∶1～3∶1)梯度洗脫得組分Fr11-Fr17，F(xiàn)r14再依次經(jīng)硅膠柱以CH2Cl2-MeOH(10∶1～3∶1)梯度洗脫得黃色固體沉淀，Sephadex LH-20以MeOH洗脫分別得化合物6(1016.7 mg)、7(16.2 mg)、8(36.3 mg)、9(26.3 mg);S5經(jīng)硅膠柱以CH2Cl2-MeOH(6∶1)洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20以MeOH洗脫得化合物10(5 mg)。

1.2.2 乙酸乙酯萃取部位抑菌活性測(cè)試

1.2.2.1 菌種和對(duì)照組選擇

選取大腸桿菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌作為供試菌;選取25.6 mg/mL鹽酸小檗堿和25 μg/mL諾氟沙星作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.2.2 抑菌活性實(shí)驗(yàn)

采用打孔法進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。用二倍稀釋法將萹蓄乙酸乙酯萃取物樣品用DMSO稀釋配制成由高濃度到低濃度的3個(gè)濃度梯度(C1=400 mg/mL，C2=200 mg/mL，C3=100 mg/mL)。以 DMSO溶液作為陰性對(duì)照，25.6 mg/mL的鹽酸小檗堿和25 μg/mL的諾氟沙星作為陽(yáng)性對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行。37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.2.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 萹蓄乙酸乙酯萃取部位抑菌活性的研究

表1 萹蓄乙酸乙酯部位提取物的抑菌效果(n=3，±s)Table 1 Inhibition zone diameters of ethyl acetate extracts from Polygonum aviculare L.on five common food born pathogenic bacteria(n=3，±s)

表1 萹蓄乙酸乙酯部位提取物的抑菌效果(n=3，±s)Table 1 Inhibition zone diameters of ethyl acetate extracts from Polygonum aviculare L.on five common food born pathogenic bacteria(n=3，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05;＊＊P ＜ 0.01.

樣品Sample濃度Concentration(mg/mL)抑菌圈直徑Inhibition zone diameters(mm)大腸桿菌Escherichia coli致病性大腸桿菌Enteropathogenic E．coli金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus傷寒桿菌Salmonella typhi痢疾桿菌Shigella dysenteriae DMSO(空白對(duì)照)control 分析純AR 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00諾氟沙星Norfloxacin 0.025 24.20±0.01＊＊ 32.18±0.02＊＊ 33.20±0.05＊＊ 32.16±0.15＊＊ 33.93±0.08＊＊鹽酸小檗堿Berberine hydrochloride 25.6 10.05±0.05＊＊ 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 6.00±0.00 C1 400 17.90±0.17＊＊ 13.70±0.26＊＊ 16.67±0.25＊＊ 11.00±0.23＊＊ 16.40±0.16＊＊C2 200 17.53±0.31＊＊ 11.57±0.31* 14.66±0.32＊＊ 9.40±0.39＊＊ 14.30±0.40＊＊C3 100 16.37±0.47* 11.00±0.20＊＊ 13.69±0.23＊＊ 9.04±0.08＊＊ 12.20±0.19＊＊

從表1可以看出，不同濃度的萹蓄乙酸乙酯部位提取物對(duì)五種供試菌均有抑菌效果，且抑菌活性的隨濃度的增加而增強(qiáng)。

2.2 萹蓄乙酸乙酯萃取部位化學(xué)成分的研究

從萹蓄乙酸乙酯部位分離得到10個(gè)化合物，分別分離鑒定為沒食子酸甲酯(1)、β-胡蘿卜甙(2)、山柰酚(3)、槲皮素(4)、沒食子酸(5)、萹蓄苷(6)、槲皮苷(7)、myricetin 3-O-(3''-O-galloyl)-rhamnopyranoside(8)、楊梅樹皮苷(9)、胡桃寧(10)。其中化合物1和8為首次從該植物中分離得到，化合物8為首次從蓼科蓼屬中分離得到。

化合物1 C8H8O5，白色針晶，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯橙紅色。1H nmR(Acetone-d6，300 MHz)δ:7.11(2H，s，H-2，H-6)，3.79(3H，s，OCH3);13C NMR(Acetoned6，75 MHz)δ:121.9(C-1)，109.9(C-2，C-6)，146.1(C-3，C-5)，138.8(C-4)，167.2(C-7)，51.9(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道的沒食子酸甲酯基本一致，化合物1鑒定為沒食子酸甲酯(methyl gallate)。

化合物2 C35H60O6，白色粉末，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下無熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯紫紅色。1H NMR(C5D5N，300 MHz)δ:0.66(3H，s，H-18)，0.86，0.99(各 3H，d，J=6.0 Hz，H-26 和H-27)，0.88(3H，d，J=6.0 Hz，H-21)，0.89(3H，t，J=7.8 Hz，H-29)，0.93(3H，s，H-19)，5.35(1H，br.s，H-6)，3.98(1H，m，H-3)，2.47(1H，m，H-17)，5.05(1H，d，J=9.0 Hz，Glu-H-1)，4.05(1H，t，J=9.0 Hz，Glu-H-2)，4.28(2H，m，Glu-H-3，Glu-H-4)，3.95(1H，m，Glu-H-5)，4.56(1H，d，J=12.0 Hz，Glu-H-6a)，4.41(1H，dd，J=2.8 Hz，12 Hz，Glu-H-6b)。1H NMR 的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報(bào)道基本一致，且與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，薄層層析上Rf值相同，鑒定該化合物為 β-胡蘿卜甙(β-daucosterol)。

化合物3 C15H10O6，黃色針晶，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯黃色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:12.47(1H，brs，5-OH)，8.03(2H，d，J=8.8 Hz，H-2'，H-6')，6.92(2H，d，J=8.8 Hz，H-3'，H-5')，6.43(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6·19(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:146.7(C-2)，135.6(C-3)，175.8(C-4)，156.1(C-5)，98.3(C-6)，164.0(C-7)，93.5(C-8)，160.6(C-9)，103.0(C-10)，121.8(C-1')，129.5(C-2')，115.4(C-3'，5')，159.1(C-4')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］報(bào)道的山柰酚基本一致，鑒定該化合物為山柰酚(kaempferol)。

化合物4 C15H10O7，黃色針晶，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯黃色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:12.48(1H，s，5-OH)，7.66(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.53(1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6')，6.87(1H，d，J=8.4 Hz，H-5')，6.39(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:146.6(C-2)，135.8(C-3)，176.0(C-4)，160.8(C-5)，98.3(C-6)，163.9(C-7)，93.3(C-8)，156.1(C-9)，102.7(C-10)，122.1(C-1')，115.0(C-2')，145.1(C-3')，147.8(C-4')，115.7(C-5')，120.0(C-6')。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］報(bào)道的槲皮素基本一致，鑒定該化合物為槲皮素(quercetin)。

化合物5 C7H6O5，白色針晶，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯土灰色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:6.91(2H，s，H-2，H-6)，9.21(2H，br s，OH-3，OH-5)。13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:120.9(C-1)，108.1(C-2，C-6)，145.5(C-3，C-5)，138.6(C-4)，167.9(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的沒食子酸基本一致，化合物5鑒定為沒食子酸(gallic acid)。

化合物6 C20H18O11，黃色針晶，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯黃色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:12.62(1H，s，5-OH)，7.56(1H，d，J=8.4 Hz，H-6')，7.48(1H，s，H-2')，6.85(1H，d，J=8.4 Hz，H-5')，6.41(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，5.58(1H，br.s，H-1'')。13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:156.4(C-2)，133.4(C-3)，177.8(C-4)，161.2(C-5)，98.8(C-6)，164.3(C-7)，93.6(C-8)，157.0(C-9)，104.0(C-10)，121.0(C-1')，115.7(C-2')，145.2(C-3')，148.5(C-4')，115.6(C-5')，121.7(C-6')，107.9(C-1″)，82.1(C-2″)，77.0(C-3″)，85.9(C-4″)，60.7(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的萹蓄苷基本一致，化合物6鑒定為萹蓄苷(avicularin)。

化合物7 C21H20O11，黃色粉末，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯黃色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:12.64(1H，br s，5-OH)，10.86(1H，br s，7-OH)，9.63(2H，br s，3'-OH，4'-OH)，7.31(1H，d，J=2.0 Hz，H-2')，7.26(1H，dd，J=2.0 Hz，8.4 Hz，H-6')，6.87(1H，d，J=8.4 Hz，H-5')，6.40(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.26(1H，br s，H-1'')，3.22 – 3.97(4H，m，H-2''– 5'')，0.83(3H，d，J=6.0 Hz，H-6'')。13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:157.2(C-2)，135.2(C-3)，178.5(C-4)，162.2(C-5)，99.5(C-6)，165.0(C-7)，94.4(C-8)，158.1(C-9)，104.9(C-10)，121.6(C-1')，116.3(C-2')，145.8(C-3')，149.3(C-4')，116.5(C-5')，121.9(C-6');rha 102.6(C-1″)，71.2(C-2″)，71.2(C-3″)，72.1(C-4″)，70.9(C-5″)，18.3(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的槲皮苷基本一致，化合物7鑒定為槲皮苷(quercitrin)。

化合物8 C28H24O16，黃色粉末，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯黃色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:12.66(1H，br s，5-OH)，10.87(1H，br s，7-OH)，6.90(2H，s，H-2'，H-6')，6.39(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，5.05(1H，brs，H-1'')，5.04(1H，dd，H-3'')，0.91(3H，d，J=5.1 Hz，H-6'')，7.05(2H，s，H-2″'，H-6″');13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:157.8(C-2)，134.6(C-3)，177.8(C-4)，161.2(C-5)，98.4(C-6)，164.2(C-7)，93.6(C-8)，156.4(C-9)，104.9(C-10)，119.5(C-1')，108.1(C-2')，145.8(C-3')，136.6(C-4')，145.9(C-5')，108.1C-6');rha:102.6(C-1'')，67.7(C-2'')，73.7(C-3'')，68.6(C-4'')，71.0(C-5'')，17.5(C-6'');3''-O-gallic acid:120.0(C-1)，108.9(C-2)，145.3(C-3)，138.2(C-4)，145.3(C-5)，108.9(C-6)，165.6(C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14，15］報(bào)道的 myricetin 3-O-(3″-O-galloyl)-rhamnopyranoside 基 本 一致，化合物8鑒定為 myricetin 3-O-(3''-O-galloyl)-rhamnopyranoside。

化合物9 C21H20O12，淡黃色粉末，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯黃色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:12.68(1H，s，5-OH)，10.88(1H，s，7-OH)，9.28(2H，s，3'-OH 5'-OH)，8.88(1H，s，4'-OH)，6.88(2H，s，H-2'，H-6')，6.37(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，5.20(1H，br s，H-1'')，0.84(3H，d，J=6.0 Hz，H-6'')。13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:157.5(C-2)，134.3(C-3)，177.8(C-4)，161.3(C-5)，98.7(C-6)，164.3(C-7)，93.6(C-8)，156.4(C-9)，104.0(C-10)，119.6(C-1')，107.9(C-2')，145.8(C-3')，136.5(C-4')，145.8(C-5')，108.0(C-6');rha 102.0(C-1″)，70.5(C-2″)，70.7(C-3″)，71.3(C-4″)，70.0(C-5″)，17.5(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］報(bào)道的楊梅樹皮苷基本一致，化合物9鑒定為楊梅樹皮苷(myricitrin)。

化合物10 C20H18O10，淡黃色粉末，薄層檢測(cè)在紫外燈254 nm下有熒光，10%硫酸-乙醇噴霧加熱顯黃色。1H NMR(DMSO-d6，300 MHz)δ:12.63(1H，s，5-OH)，10.89(1H，s，7-OH)，10.21(1H，s，4'-OH)，8.03(2H，d，J=9.0 Hz，H-2'，H-6')，6.90(2H，d，J=9.0 Hz，H-3'，H-5')，6.45(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，5.62(1H，s，H-1'')。13C NMR(DMSO-d6，75 MHz)δ:156.4(C-2)，134.4(C-3)，177.7(C-4)，161.2(C-5)，98.7(C-6)，164.5(C-7)，93.7(C-8)，156.7(C-9)，104.0(C-10)，120.7(C-1')，130.8(C-2')，115.4(C-3')，160.0(C-4')，115.4(C-5')，130.8(C-6');ara 108.1(C-1″)，82.1(C-2″)，77.1(C-3″)，86.3(C-4″)，60.9(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］報(bào)道的胡桃寧基本一致，化合物10鑒定為胡桃寧(juglanin)。

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