麥飯石載體枯草芽孢桿菌飼料添加劑應(yīng)用于刺參養(yǎng)殖的研究

溫志新，孫永欣，李亞潔，都興范

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連 116024）

麥飯石是一種高效無毒的藥物礦石，含有多種對生物生長發(fā)育有益的常量元素、微量元素以及被稱作動物生長調(diào)節(jié)劑的稀土元素和微量氨基酸（王銀葉等，2003）。麥飯石因具有礦化性、吸附性，現(xiàn)已廣泛用于礦化飲用水生產(chǎn)，并且可以有效捕獲水體中重金屬和細(xì)菌（王維清等，2005；王蘇新，2003）。在飼料中添加麥飯石比無機(jī)鹽能更好地補(bǔ)充某些營養(yǎng)元素的不足和缺乏，從而促進(jìn)魚蝦的生長發(fā)育（董志巖等，1997）。麥飯石作為載體固定益生菌擴(kuò)大了麥飯石的使用范圍，該方法避免了微生物在水體中懸浮流失并保證細(xì)胞酶活性不受影響，并且價格便宜且制備過程簡單，現(xiàn)已廣泛用于水質(zhì)凈化（張躍峰，2006）。

由于刺參攝食的特殊性，將益生菌直接添加到飼料中會造成其在水體中散失。因此，本試驗利用麥飯石吸附性對枯草芽孢桿菌固定制備成麥飯石載體枯草芽孢桿菌（下稱載菌麥飯石），添加到刺參飼料中，測定其對刺參生長和抗病力的影響及對刺參養(yǎng)殖廢水氨氮和亞硝酸鹽清除能力，為益生菌在刺參養(yǎng)殖中的應(yīng)用及合理開發(fā)麥飯石資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 麥飯石載體枯草芽孢桿菌制備 麥飯石微粉（200目），產(chǎn)于遼寧阜新。飼料級枯草芽孢桿菌菌粉購自滄州華雨藥業(yè)有限公司。

1.1.1 枯草芽孢桿菌菌液制備 取少量菌粉 （約1接種環(huán)）接種于枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基（20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+0.5 g牛肉膏溶于1 L海水，pH 7.5）中，于搖床中培養(yǎng)（36 ℃、140 r/min）14 h，菌液濃度達(dá)到108個/mL。

1.1.2 菌體細(xì)胞固定和成品制備 每1 L菌液中加入250 g麥飯石微粉，室溫170 r/min振蕩1.5 h后靜置30 min，棄上清液，沉淀于烘箱中（60℃）烘干后用粉碎機(jī)粉碎，顆粒粒度≤100目。

1.2 試驗刺參 試驗用刺參為大連瓦房店某大型刺參育苗場同批刺參幼體（小白點），于養(yǎng)殖場室內(nèi)育苗池（體積為25 m3）內(nèi)工廠化養(yǎng)殖，每天更換1/3體積海水，每周全換水一次。每天下午投喂飼料，水溫在13～16℃，鹽度保持在28‰ ～31‰。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 養(yǎng)殖試驗 養(yǎng)殖試驗分4個試驗組，分別是對照組、枯草芽孢桿菌組、麥飯石組和載菌麥飯石組，每個試驗組為一個育苗池的全部幼體（約上億個體），養(yǎng)殖試驗共60 d，試驗結(jié)束稱量體重。

1.3.2 試驗飼料 分別在基礎(chǔ)飼料中添加5%枯草芽孢桿菌、5%麥飯石、5%載菌麥飯石。各組飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 各組刺參飼料組成及營養(yǎng)水平 %

1.3.3 攻毒試驗 試驗結(jié)束后，每組取30只刺參個體，用燦爛弧菌（Vibrio splendidus，本研究所保存菌種，密度≥1012個/mL）和假交替單胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens，荷蘭真菌生物多樣性中心，菌種號：NCCB 100134，密度≥1012個/mL）混合菌液對刺參體腔注射，每天換水，少量投喂，15 d后統(tǒng)計存活率。

1.3.4 不同飼料添加成分對養(yǎng)殖廢水中氨氮、亞硝酸鹽的影響 于30 L刺參養(yǎng)殖廢水中分別投入150 mg/kg枯草芽孢桿菌粉、麥飯石粉和載菌麥飯石，并設(shè)空白對照組。分別于試驗0、1、3、7 d取樣測定氨氮和亞硝酸鹽。期間不充氣，添加的劑量參考麥飯石凈化海參圈的常用量。

1.3.5 水質(zhì)測定方法 用奈氏試劑法測定氨氮；用重氮-偶氮比色法測定亞硝酸鹽。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan’s多重比較，存活率采用X2獨立性檢驗統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥飯石載體枯草芽孢桿菌對刺參體重的影響 經(jīng)過60 d養(yǎng)殖，各組刺參幼體體重如表2所示，飼料中添加枯草芽孢桿菌組刺參平均體重低于對照組，麥飯石組和載菌麥飯石組平均體重分別比對照組高18.46%和22.80%。

表2 各試驗組刺參體重

2.2 攻毒試驗 由表3可見，各試驗組刺參存活率均高于對照組，單獨使用芽孢桿菌和麥飯石并未顯著提高攻毒存活率，只有載菌麥飯石組存活率較對照組提高66%（P＜0.05）。

表3 攻毒后各組刺參存活率

2.3 麥飯石載體枯草芽孢桿菌對養(yǎng)殖廢水中氨氮的影響 經(jīng)過7 d的4次測定，對照組、芽孢桿菌組和麥飯石組水體氨氮值不斷上升，芽孢桿菌組始終高于對照組，麥飯石組始終低于對照組，并在第3天時差異顯著（P＜0.05）；芽孢桿菌經(jīng)麥飯石固定后，其對水體氨氮去除效果雖然在第1天和第3天略差于麥飯石，但仍優(yōu)于對照組和芽孢桿菌組，而在第7天時，氨氮值最低，且顯著低于其他各組（P＜0.05）。單獨使用枯草芽孢桿菌對水體氨氮未表現(xiàn)出去除能力，反而造成氨氮值升高（圖 1）。

圖1 麥飯石載體枯草芽孢桿菌去除水體氨氮效果

2.4 麥飯石載體枯草芽孢桿菌對養(yǎng)殖廢水中亞硝酸鹽的影響 在4次測定中，麥飯石在第1天時對水體中亞硝酸鹽去除效果最好，顯著低于對照組（P ＜ 0.05），在第 3、7天時，載菌麥飯石對水體亞硝酸鹽去除效果最佳，低于其他組，且顯著低于對照組（P＜0.05）。單獨使用枯草芽孢桿菌在前期會造成亞硝酸鹽值升高，在第7天測定時才表現(xiàn)出降解能力（圖2）。

圖2 麥飯石載體枯草芽孢桿菌去除水體亞硝酸鹽效果

3 討論

在水產(chǎn)動物腸道中，枯草芽孢桿菌孢子活化后消耗大量氧氣，維持腸道厭氧環(huán)境，抑制致病菌生長，并能產(chǎn)生抗弧菌（黃汝添等，2006）和酵母菌（謝海平，2003）等活性物質(zhì)，對魚類嗜水氣單胞菌有強(qiáng)烈抑殺作用（潘曉藝等，2007）。此外，枯草芽孢桿菌能通過合成維生素和輔酶因子或促進(jìn)酶促反應(yīng)提高腸道消化酶活性（Gatesoupe，1999）。本試驗中，刺參攝食添加枯草芽孢桿菌的飼料未表現(xiàn)出高生長率和抗病力，原因可能是刺參攝食緩慢，芽孢桿菌被攝食之前已大部分散失，從而未被刺參有效利用。這也是益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖實際應(yīng)用中的局限。

麥飯石作為飼料添加劑能提高水產(chǎn)動物增重率和成活率。董志巖等（1997）在幼鰻飼料中添加2%麥飯石，鰻魚增重率提高7.88%，飼料報酬提高6.21%，成活率提高4.95%。趙元鳳等（2001）研究報道，在鮑魚基礎(chǔ)飼料中添加1%麥飯石能顯著提高皺紋盤鮑（Haliotis discus hannat Ino）平均增重率。在本試驗的刺參飼料中添加5%麥飯石，刺參增重率提高18.46%，攻毒存活率提高20%，這是因為麥飯石富含畜禽生長所必需的鐵、硒、鈷等十幾種微量元素，并且麥飯石可使動物血中的γ-球蛋白增加，T淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，從而使機(jī)體的免疫能力增強(qiáng)（任道泉等，1998）。

由于麥飯石呈多孔性、海綿狀結(jié)構(gòu)，具有良好的物理吸附性能，因此可以作為細(xì)菌吸附載體，對目的微生物固定，防止有益菌在水體中散失。本試驗利用麥飯石對枯草芽孢桿菌的吸附性對其固定，結(jié)果表明，該方法制備的載菌麥飯石促進(jìn)刺參增重和抗病力的效果優(yōu)于二者單獨使用。由于二者的協(xié)同效果，不僅利用麥飯石補(bǔ)充了礦物質(zhì)元素，還利用枯草芽孢桿菌產(chǎn)生胞外消化酶和抗菌物質(zhì)等，因此不論在增重率和抗病力方面均優(yōu)于芽孢桿菌或麥飯石單獨使用。

養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽濃度是影響水產(chǎn)動物正常生長和水質(zhì)的關(guān)鍵因素，在水族箱充氣養(yǎng)殖過程中，水體氨氮含量較少，而即使日換水量達(dá)到1/3，亞硝酸鹽濃度仍較高（姚雪梅等，2007）。糙海參（Holothuria scabra）長期處于較高的亞硝酸鹽濃度，食欲下降，排便量減少，當(dāng)亞硝酸鹽濃度超過1.8 mg/L時，海參發(fā)生吐腸。解剖腸道也發(fā)現(xiàn)腸道壁變硬，失去彈性。雖然海參沒有死亡，但明顯減重（姚雪梅等，2007）。由于在實際養(yǎng)殖生產(chǎn)中，進(jìn)入人工養(yǎng)殖系統(tǒng)的氮素近90%源于投入餌料（Lorenzen等，1997），因此飼料中添加吸附或降解氨氮和亞硝酸鹽的物質(zhì)可在源頭上直接降低水質(zhì)污染并提高餌料利用率。枯草芽孢桿菌能明顯降低養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸鹽濃度，改善養(yǎng)殖水質(zhì)（Liu和 Han，2004）。但本試驗中，枯草芽孢桿菌對水體氨氮和亞硝酸鹽未表現(xiàn)出清除作用，這與駱?biāo)囄模?009）研究結(jié)果一致，原因可能與水體溶氧不足、水溫較低以及水體缺乏藻類有關(guān)。此外，枯草芽孢桿菌屬嚴(yán)格需氧微生物，大量芽孢桿菌迅速消耗氧氣，導(dǎo)致厭氧菌增多，由于厭氧菌對氮的同化少，故產(chǎn)生更多的NH3（Reddy等，1996）。而亞硝酸鹽是水體氨氮轉(zhuǎn)化成硝酸鹽的中間產(chǎn)物，是在亞硝化菌和氧氣作用下完成的，亞硝酸鹽最終經(jīng)過硝化細(xì)菌作用轉(zhuǎn)變?yōu)橄跛猁}，但硝化細(xì)菌繁殖速度很慢，大約20 h一代，因此水體中亞硝酸鹽易升高（楊鏗等，2008）。本試驗芽孢桿菌組亞硝酸鹽濃度前期高于對照組，之后才降低，分析可能是受到水體氨氮和溶氧的雙重影響，隨著氨氮濃度升高，水體溶氧快速被異養(yǎng)菌利用，接著被大量轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽。因此，亞硝酸鹽濃度持續(xù)上升。最后，芽孢桿菌組氨氮值異常升高，而亞硝酸鹽有所降低，很可能是溶氧不足，導(dǎo)致亞硝酸鹽又轉(zhuǎn)變成氨氮（Keller等，2002）。因此，使用芽孢桿菌時必須保證充足的溶氧。

本試驗中麥飯石對水質(zhì)凈化作用較為明顯，短期（3 d和1 d）對水體中氨氮和亞硝酸鹽去除效果迅速，這與其顯著的吸附性能有關(guān) （石玉臣等，2000）。而載菌麥飯石對水質(zhì)的凈化作用為長期對水體氨氮（7 d）和亞硝酸鹽（3 d后）的清除能力表現(xiàn)出較佳的效果，這與張躍峰（2006）試驗結(jié)果一致，分析認(rèn)為是枯草芽孢桿菌發(fā)揮了作用。麥飯石本身攜帶有大量氧氣，并且能吸附水體中氨氮和亞硝酸鹽，而枯草芽孢桿菌在有麥飯石提供的氧氣存在時，發(fā)揮較好的氨氮和亞硝酸鹽分解能力，因此在本試驗中后期表現(xiàn)出比麥飯石更好的水質(zhì)改善作用。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌經(jīng)過麥飯石固定后，作為飼料添加劑按5%添加能明顯提高刺參幼體生長性能和抗病力，所添加成分可在3～7 d顯著降低水體中的氨氮和亞硝酸鹽濃度，從而降低飼料給養(yǎng)殖水體帶來的環(huán)境壓力。

[1]董志巖，童斌，繆伏榮，等.鰻魚飼料添加麥飯石的試驗[J].飼料研究，1997，12：9 ～ 10.

[2]黃汝添，謝海平，陸勇軍，等.枯草芽孢桿菌Bs-1拮抗溶藻弧菌的特性[J].熱帶海洋學(xué)報，2006，25（4）：51 ～ 55.

[3]駱?biāo)囄?刺參有益菌制劑的研制與應(yīng)用研究：[碩士學(xué)位論文][D].青島：中國海洋大學(xué)，2009.

[4]潘曉藝，沈錦玉，余旭平，等.水產(chǎn)養(yǎng)殖中枯草芽孢桿菌的分子鑒定[J].水生生物學(xué)報，2007，31（1）：139 ～ 141.

[5]任道泉，程軍，郭宏偉.麥飯石在動物養(yǎng)殖業(yè)中的作用[J].塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報，1998，10（2）：65 ～ 67.

[6]石玉臣，柴永昌，李壽山.山東幾處典型麥飯石礦床的地質(zhì)特征及其主要物化性能[J].山東地質(zhì)，2000，16（2）：17 ～ 23.

[7]王蘇新.麥飯石特性及作用分析[J].江蘇陶瓷，2003，36（1）：1 ～ 2.

[8]王維清，馮啟明，袁昌來.一種新型的無機(jī)抗菌劑載體—麥飯石[J].中國礦業(yè)，2005，14（1）：41 ～ 44.

[9]王銀葉，馬育蓮，史艷嬌.活性麥飯石結(jié)構(gòu)的探討及應(yīng)用[J].天津化工，2003，17（2）：7 ～ 9.

[10]謝海平，黃暉，黃登峰，等.海洋枯草芽孢桿菌Bs—1產(chǎn)生多種抗真菌活性物質(zhì)[J].中山大學(xué)學(xué)報，2003，42（3）：122 ～ 123.

[11]楊鏗，冷加華，文國，等.對蝦養(yǎng)殖中后期亞硝酸鹽過高問題的處理與預(yù)防[J].中國水產(chǎn)，2008，8：53 ～ 55.

[12]姚雪梅，王紅勇，邢少雷，等.不同水溫和水質(zhì)理化因子對糙海參攝食、生長影響研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2007，26（5）：292 ～ 295.

[13]張躍峰.固定化有益微生物技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的初步研究：[碩士學(xué)位論文][D].青島：中國海洋大學(xué)，2006.

[14]趙元鳳，呂景才，楊越，等.麥飯石、稀土作為鯉魚、皺紋盤鮑飼料添加劑研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報，2001，20（4）：287 ～ 291.

[15]Gatesoupe F J.The use of probiotics in aquaculture[J].Aquaculture，1999，180：147 ～ 165.

[16]Keller J，Yuan Z，Blackall L L.Integrating process engineering and microbiology tools to advance activated sludge wastewater treatment research and development reviews in environmental[J].Sci&Biotechnol，2002，1：83 ～ 97.

[17]Liu F，Han W Y.Reuse strategy of wastewater in prawn nursery by microbial remediation[J].Aquaculture，2004，230（1-4）：281 ～ 296.

[18]Lorenzen K，Struve J，Cowan V J.Impact of farming intensity and water management on nitrogen dynamics in intensive pond culture：a mathematical model applied to Thai commercial shrimp farms[J].Aquaculture Res，1997，28：493～507.

[19]Reddy K R，F(xiàn)isher M M，Ivanoff D.Resuspension and diffusive flux of nitrogen and phosphorus in a hypereutrophic lake[J].J Environ Qual，1996，25：363～371.■