球孢白僵菌孢子的耐逆性研究*

張 航，崔 陽，董曉宇，馮樹丹＊＊，徐文靜

(1.哈爾濱師范大學(xué);2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院)

0 引言

亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis是我國玉米生產(chǎn)上最重要的害蟲，在不同生育期危害玉米，在玉米心葉期取食葉肉或蛀食未展開心葉，造成“花葉”;抽雄后鉆蛀莖稈;在穗期則直接蛀食雌穗、嫩粒，造成籽粒缺損、霉?fàn)€，品質(zhì)降低［1］，對(duì)玉米的產(chǎn)量和質(zhì)量影響很大.近年來，隨著玉米種植面積的擴(kuò)大加之全球氣候變暖，玉米螟安全越冬基數(shù)增高，導(dǎo)致玉米螟發(fā)生呈加重趨勢(shì)［2］.球孢白僵菌是目前世界上研究和應(yīng)用最多的病原真菌之一，它符合生物制劑的一些基本要求，即對(duì)溫血?jiǎng)游锖椭参餆o害，容易培養(yǎng)，致病力強(qiáng)，防治害蟲效果好和廣譜等［3］.球孢白僵菌的毒力受環(huán)境因子的影響很大［4］.因此，只有了解球孢白僵菌的特性及耐逆性，研究白僵菌各個(gè)條件的極性界點(diǎn)，才可以讓球孢白僵菌應(yīng)用到更廣泛的極性環(huán)境中，完善球孢白僵菌應(yīng)用范圍，使球孢白僵菌劑型更加完整.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

球孢白僵菌D1－5，保存于吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室.

1.1.2 培養(yǎng)基

薩氏培養(yǎng)基(SDY):4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、去離子水1000mL，自然pH值.液體培養(yǎng)基(SDY):不添加瓊脂的薩氏培養(yǎng)基［5］

1.1.3 藥品

蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、卡納、頭孢、吐溫80.

1.1.4 試驗(yàn)器材

生物顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、蘇州凈化SW－CJ－2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)、榮華牌JB－4定時(shí)雙向電子恒溫磁力攪拌器、電子天平、SANYO MLS－3780全自動(dòng)高壓滅菌鍋、精宏牌H2P－250型空氣浴振蕩器

1.2 白僵菌侵染致病機(jī)理

白僵菌侵入蟲體一般經(jīng)歷主要分為以下階段:

(1)分生孢子附著、萌發(fā).真菌在昆蟲體表的附著能力直接影響著對(duì)昆蟲的致死效率.國內(nèi)外對(duì)附著胞形成條件的研究較少，國外學(xué)者對(duì)綠僵菌附著胞形成的溫度、營養(yǎng)、pH已做了一些相關(guān)研究，但未作系統(tǒng)全面的研究.國內(nèi)的研究僅僅是在觀察白僵菌在昆蟲表面分化出附著胞的效果，但未作進(jìn)一步研究［6－8］.

(2)穿透表皮.入侵是機(jī)械壓力和酶共同作用的結(jié)果［9－10］.這些酶在菌體侵染過程中起到溶解表皮，有利于侵染的作用.白僵菌分泌的各種水解酶，主要包括蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶及酯酶［11－12］，這些酶在穿透過程中起著重要作用，其活力高低是決定真菌侵染力的首要因素［13－14］.

(3)分泌毒素寄主死亡.有些被侵染的蟲體，在蟲身未全部布滿菌絲之前，已經(jīng)死亡，這可能與真菌毒素分泌有關(guān).胡豐林等從綠僵菌培養(yǎng)液中分離出五種破壞素［15］.高英等在利用高速逆流色譜從油松毛蟲病源真菌布氏白僵菌菌株代謝液中分離純化出具有殺蟲活性成分的小分子毒素物質(zhì)間甲基苯甲酸甲酯和對(duì)甲基苯甲酸甲酯［16］.

(4)菌絲穿出表皮，產(chǎn)生分生孢子.利用GFP(Green Fluorescent Protein)表達(dá)系統(tǒng)可以檢測(cè)球孢白僵菌侵染的過程［17］.

此外，不同的受體也會(huì)影響其侵染效果.蟲生真菌中白僵菌和綠僵菌、擬青霉素等真菌寄主雖然廣泛，同種菌株的單體形態(tài)上差別也不顯著，但是面對(duì)不同種類的昆蟲其致病力卻存在差異.據(jù)報(bào)道，在蠶區(qū)用來自不同昆蟲的白僵菌菌株防治大豆食心蟲和玉米螟，結(jié)果表明野外條件下應(yīng)用白僵菌防治玉米螟對(duì)養(yǎng)蠶無影響［18］.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溫度對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)耐逆性影響的試驗(yàn)方法

用0.05%的滅菌后的吐溫80溶液打散混勻0.1 g球孢白僵菌菌粉，取100 μL加900 μL無菌水稀釋后分別置于 15、19、22、25、28、31、34、37、40、45℃下暗培養(yǎng)接到滅菌后的SDY液體培養(yǎng)基(9 mL/瓶)上，之后在26℃振蕩18～20 h后，分別檢測(cè) 1、2、4、8、24 h 萌發(fā)情況，用顯微鏡每瓶觀察3個(gè)視野，取平均值，算出萌發(fā)率，每菌株設(shè)置一個(gè)自然溫度的對(duì)照處理(22℃室溫為自然溫度).

1.3.2 pH對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)耐逆性影響的試驗(yàn)方法

滅菌后的SDY液體培養(yǎng)基(9 mL/瓶)在無菌條件下用0.1 mol/L的HCl和0.1 mol/L的NaOH將SDY培養(yǎng)基分別調(diào)成 pH 為1、3、5、6、7、8、9、11、14 共9 個(gè)梯度，加入1mL 孢子濃度為1×107個(gè)/mL的孢子懸液，26℃振蕩培養(yǎng)18～20 h后分別觀察孢子萌發(fā)情況，用顯微鏡每瓶觀察3個(gè)視野，取平均值，算出萌發(fā)率.每菌株設(shè)置一個(gè)自然pH的對(duì)照處理.

1.3.3 紫外強(qiáng)度對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)耐逆性影響的試驗(yàn)方法

用0.05%的無菌吐溫80溶液打散混勻0.1 g菌粉，取100μL加900μL無菌水稀釋接到滅菌后的SDY液體培養(yǎng)基(9 mL/瓶)上，置于6000 μw/cm2強(qiáng)度的紫外照射下在 60、80、100、120、240、480min后在26℃振蕩箱振蕩18 ～20 h后，分別看萌發(fā)情況，用顯微鏡每瓶觀察3個(gè)視野，取平均值，算出萌發(fā)率.每菌株設(shè)置一個(gè)自然條件的對(duì)照處理.

白僵菌萌發(fā)率計(jì)算:萌發(fā)率=已萌發(fā)孢子÷(已萌發(fā)孢子+未萌發(fā)孢子)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)率的影響

由表1和圖1可知，供試球孢白僵菌孢子有著較寬的溫度萌發(fā)范圍，在供試的溫度范圍內(nèi)(15～31℃)均能正常萌發(fā)，且萌發(fā)率較高.31～45℃萌發(fā)率受溫度影響較大.尤其在45℃時(shí)白僵菌孢子萌發(fā)率隨著處理時(shí)間增大萌發(fā)率極速降低直至不萌發(fā).在15～25℃時(shí)，球孢白僵菌的萌發(fā)率隨溫度的升高而增加，并且與溫度持續(xù)時(shí)間影響不大.在25℃條件下萌發(fā)率達(dá)到最大值，當(dāng)溫度高于28℃后萌發(fā)率隨溫度的升高而降低，在超過31℃后萌發(fā)率迅速下降.19～28℃是最適合球孢白僵菌萌發(fā)的溫度范圍，而過高和過低的溫度均不利于球孢白僵菌孢子的萌發(fā)，因此，在室內(nèi)萌發(fā)該球孢白僵菌孢子時(shí)應(yīng)盡量避免過高或過低的溫度條件，田間使用時(shí)盡量選擇合適的季節(jié)和時(shí)間.但在極高溫度如表1中45℃白僵菌孢子依然能萌發(fā)只要不進(jìn)行長時(shí)間的高溫密集照射，也依然有可能在高溫環(huán)境中加以利用.

表1 溫度對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)率的影響%

圖1 溫度對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)率影響的折線圖

2.2 pH對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)率的影響

不同pH對(duì)白僵菌孢子的影響測(cè)定結(jié)果見表2.由表2和圖2可知，在ck對(duì)照組對(duì)照下我們發(fā)現(xiàn):在pH 3.0～11.0范圍內(nèi)均可萌發(fā)，但不同pH對(duì)孢子萌發(fā)有明顯的影響.當(dāng)pH在3.0～7.0之間時(shí)，球孢白僵菌萌發(fā)率孢子隨pH升高而增長;當(dāng)pH＞7時(shí)，孢子萌發(fā)率隨pH升高而下降.白僵菌孢子萌發(fā)最適pH為7.0.

表2 pH對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)率的影響

2.3 紫外強(qiáng)度對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)率的影響

圖2 pH對(duì)球孢白僵菌孢子萌發(fā)率的影響的柱型圖

由表3和圖3可見，紫外線照射對(duì)白僵菌孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，隨著照射時(shí)間的增加，孢子萌發(fā)率明顯降低，照射60、80、100 min后的孢子萌發(fā)率分別為72.70%、50.30%和20.60%，而在240 min時(shí)萌發(fā)率已經(jīng)降低到6.03%，說明球孢白僵菌孢子不能耐紫外線長時(shí)間照射.長時(shí)間的照射孢子會(huì)完全失活不萌發(fā).

表3 紫外線照射對(duì)球孢白僵菌萌發(fā)率的影響

圖3 紫外線照射對(duì)球孢白僵菌萌發(fā)率的影響柱狀圖

3 小結(jié)與討論

適宜的環(huán)境可以使白僵菌更好的利用營養(yǎng)物質(zhì)生長發(fā)育［19］，提高對(duì)害蟲的致病力.在影響球孢白僵菌田間應(yīng)用的環(huán)境因素中，溫度、pH和紫外線照射至關(guān)重要.研究表明，過低和過高的溫度均不適于球孢白僵菌孢子的萌發(fā)，19～28℃是其最適的生長溫度范圍.隨著相對(duì)濕度的增加菌絲的生長和孢子萌發(fā)率都升高，當(dāng)相對(duì)濕度達(dá)到100%時(shí)，生長量和萌發(fā)率均達(dá)到峰值，相對(duì)濕度低于75%以下白僵菌的萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制.在連續(xù)干旱的年份或地區(qū)不適合噴灑白僵菌，只有在較高的濕度下孢子才能萌發(fā)侵入蟲體，所以應(yīng)用白僵菌防治玉米螟時(shí)一定要選擇好氣候條件.黃淮海玉米產(chǎn)區(qū)田間應(yīng)用白僵菌防治玉米螟一般是在7月份的小喇叭口時(shí)期，此時(shí)正值高濕季節(jié)，喇叭口內(nèi)的濕度較大有利于白僵菌生長侵染.而且施用白僵菌的同時(shí)也要考慮土地及環(huán)境pH，在噴灑白僵菌時(shí)可以人為選擇高濕環(huán)境促使孢子萌發(fā)，如在雨后或澆地后將白僵菌施入玉米心葉內(nèi).紫外線照射可強(qiáng)烈抑制白僵菌孢子的萌發(fā)，從而導(dǎo)致菌株毒力下降，所以為了防止紫外線的輻射，田間施藥時(shí)可將其加入一些抗壞血酸等化學(xué)保護(hù)劑［20］.

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