復方中草藥提取物對鯉魚非特異性免疫及生長性能的影響

吳衛(wèi)星+申亮+張秀文+齊遵利

摘要：將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定的比例制成復方添加劑。將其以0（對照組）、0.1%（B1）、0.2%（B2）、0.3%（B3）的比例加入到基礎飼料中制成顆粒膨化飼料投喂鯉魚，研究復方中草藥提取物對鯉魚非特異性免疫及生長性能的影響。結果表明，鯉魚血清中的過氧化氫酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶的活性均強于對照組，但是B2組的鯉魚又顯著強于其他3組；飼養(yǎng)后42 d，B1組和B2組鯉魚體質(zhì)量均高于對照組。

關鍵詞：復方中草藥；鯉魚；非特異性免疫；生長性能

中圖分類號：S942.5 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0236-03

近20年來，人們逐漸發(fā)現(xiàn)抗生素和激素這些添加劑的應用對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展起一定的促進作用，但同時也帶來了不可避免的負面效應。抗生素的大量使用和濫用破壞了動物體內(nèi)微生態(tài)的平衡，導致耐藥菌株的產(chǎn)生，使動物免疫力下降^[1]。因此，世界上許多國家先后作出限用或禁用抗生素作飼料添加劑的決定，特別是歐盟已法定從 2000 年開始所有成員國全面禁止使用抗生素作飼料添加劑。2006 年，因濫用抗生素引起的“多寶魚事件”給我國大菱鲆主要養(yǎng)殖區(qū)（山東、河北）造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴重影響了大菱鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展。激素類的大量使用使動物體內(nèi)的非特異性免疫能力下降^[2]，所以天然的中草藥添加劑引起了國內(nèi)外的重視。

中草藥飼料添加劑是以自然界中動物、植物等為原料加工而成的飼料添加劑，具有高效、低毒、低殘留等優(yōu)點^[3]。但是，傳統(tǒng)的中草藥添加劑往往是將中草藥粉碎后直接添加到飼料中進行投喂的，存在藥效慢、添加量大、適口性差、成本高等缺點。為了保證中草藥添加劑的效果，本試驗采用高濃度中草藥和純中草藥提取物進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用魚

試驗魚為天津市換新水產(chǎn)良種場培育的健康鯉魚，規(guī)格約150 g/尾。鯉魚采購后，先用5%食鹽水浸泡20 min消毒，然后放入暫養(yǎng)池內(nèi)馴化2周。暫養(yǎng)期間，投喂飼料為基礎飼料，以鯉魚出現(xiàn)有規(guī)律攝食為馴化指標。

1.1.2 試驗藥品

試驗藥品成分為黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮，均購自河北征宇制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計與管理

將各試驗藥品根據(jù)中草藥藥理及相互配伍原則配制，分別以0（對照）、0.1%（B1）、0.2%（B2）、0.3%（B3）的比例加入到基礎飼料中，每組3個平行，每個平行放置25尾試驗魚，分別隨機放入12個網(wǎng)箱內(nèi)。每天08：00、12：00和16：00定時投喂，每天的投喂量約為體質(zhì)量的3%，隔天09：00清池換水1/4，全天充氧，水溫控制在 25 ℃ 左右。

1.2.2 生長指標的測定

喂養(yǎng)42 d后，每組撈取25尾魚稱重，計算各組魚的相對增重率和成活率。每天檢查草魚的發(fā)病或死亡情況，做好記錄，最后統(tǒng)計各組的成活率。飼料系數(shù)（CF）=飼料消耗量/增加的質(zhì)量；相對增重率=（末尾平均體質(zhì)量-初尾平均體質(zhì)量）/初尾平均體質(zhì)量×100%；成活率=試驗末魚總數(shù)/試驗初魚總數(shù)×100%。

1.2.3 生化指標的測定

1.2.3.1 血清的采集及制備

分別在試驗后14、28、42 d 時，從每個試驗處理組隨機取2尾魚，用盛有肝素鈉的一次性注射器采血2 mL，立即輕輕搖勻，使血液抗凝，置于 4 ℃ 冰箱內(nèi)保存。

1.2.3.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的SOD試劑盒測定。原理：SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，通過黃嘌呤及其氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈紫紅色，用可見光分光光度計測定其吸光度；當樣品中含有SOD時，則因?qū)Τ蹶庪x子自由基專一性的抑制作用使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度低于對照管。定義：1 mL反應液中SOD抑制率達到50%時所對應的SOD量為1個活性單位（U）。

1.2.3.3 溶菌酶（LSZ）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的溶菌酶試劑盒測定。原理：在一定濃度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細菌細胞壁上肽聚糖而使細菌裂解濃度降低，透光度增強，因此根據(jù)透光度變化來推測溶菌酶的活性。定義：在溫度為37 ℃、波長為530 nm下，1 min內(nèi)引起吸光度下降0.001為1個活性單位。

1.2.3.4 過氧化氫酶（CAT）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的過氧化氫酶試劑盒測定。原理：CAT分解H2O2的反應可通過鉬酸銨而迅速中止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡合物，通過測定其生成量可計算出CAT的活性。定義：1 mL血清或血漿1 s分解1 μmol的H2O2的量為1個活力單位（U）。

1.2.3.5 酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活性的測定

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶試劑盒測定。原理：酸性磷酸酶或者堿性磷酸酶在分解產(chǎn)生磷酸苯二鈉的同時產(chǎn)生游離酚和磷酸，酚在堿性溶液中與4-氨基安替吡啉作用經(jīng)鐵氰化鉀氧化生成紅色醌衍生物，根據(jù)紅色深淺可以測定ACP、AKP的活性。ACP活性單位的定義：100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用30 min時產(chǎn)生1 mg酚為1個金式單位。AKP活性單位的定義：100 mL血清在37 ℃與基質(zhì)作用15 min時產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.2.3.6 谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性的測定endprint

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的GOT試劑盒測定。GOT能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移置換氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應過程中自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用產(chǎn)生2，4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境中顯棕色，比色后可得出其活性。定義：1 mL血清，反應液總?cè)萘? mL，340 nm波長，1 cm光徑，25 ℃，1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，將NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001為1個卡門氏單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理，采用一般線性模型進行比較以及單因素方差分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

由表1可知，6周后添加復方中草藥的飼料能使鯉魚的生長性能有所增強。但是，B1組的增重效果與B3組差異不顯著；B2組的增重率顯著高于其他3組（P<0.05），但其飼料系數(shù)顯著低于其他3組（P<0.05）。

3 結論與討論

3.1 復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

本試驗是按照醫(yī)學配伍的原則將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定比例配制的。結果表明，復方中草藥添加劑能夠提高試驗組鯉魚增重率，降低飼料系數(shù)，其中B2組效果較明顯，這一結果和許多學者的試驗結果一致。例如，齊遵利等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加黃芪、黃芩、大黃、大蒜能促進草魚的生長，降低飼料系數(shù)^[4]；阮國良等發(fā)現(xiàn)，五加皮、黃芪、茯苓及這3 種中藥的混合物均對黃鱔的增重有顯著的促進作用，且五加皮對黃鱔的增重最明顯^[5]；童圣英等發(fā)現(xiàn)，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有機酸，對皺紋盤鮑具有明顯的誘食作用^[6]；曾虹等在鯉魚餌料中添加11 mg/kg大蒜素，結果發(fā)現(xiàn)其可顯著提高鯉魚成活率2.6%、增重率14.3%，同時還能提高飼料轉(zhuǎn)化率11%^[7]。

3.2 復方中草藥添加劑對鯉魚非特異性免疫的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，在基礎飼料中添加不同劑量的復方中草藥提取物能提高草魚的免疫力和抗病力，表現(xiàn)為血清中CAT、LSZ、SOD活性均顯著高于對照組。各組的輔助免疫指標ACP、AKP、GOT活性差異不大，說明試驗采樣的動物基本生理指標差異不大，沒有在得病時被隨機取樣。蔡中華等用中藥大黃、黃連、花粉、無花果4種中草藥喂養(yǎng)鯉魚，結果發(fā)現(xiàn)，魚體免疫器官質(zhì)量增加，溶菌物質(zhì)的溶菌活性及吞噬能力增強，魚體特異性免疫能力顯著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等喂養(yǎng)河蟹，通過檢測河蟹的血細胞吞噬活性、血清凝集效價及血清殺菌活性等免疫學指標后證實，該添加劑可顯著提高河蟹機體的免疫功能^[9]。Sun等研究了黃芪多糖對仿刺參免疫的影響，結果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能促進仿刺參體腔細胞的吞噬能力^[10]。Ying等確認了黃芪和靈芝能提高鯉魚白細胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等將黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍根5味中草藥等比的水提取物分別按質(zhì)量分數(shù)1%、2%、4%、8%的比例添加到基礎飼料中飼喂草魚，結果顯示，各組草魚的LSZ、SOD活性均極顯著增強了^[12]。

綜合復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能和非特異性免疫指標的綜合比較得出，B2組鯉魚生長和非特異免疫性能均顯著強于其他3組。因此，在基礎飼料中添加0.2%復方中草藥添加劑效果最佳。

參考文獻：

[1]邱楚武. 抗菌素的合理選用[J]. 中國飼料，1998（4）：42-44.

[2]趙振山，高貴琴. 魚類必需脂肪酸營養(yǎng)研究進展[J]. 飼料研究，1996（12）：12-15.

[3]謝仲權，牛樹琦.天然植物飼料添加劑生產(chǎn)技術與質(zhì)量標準[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學技術出版社，2004：23-28.

[4]齊遵利，張秀文，孫步太，等. 復方中草藥飼料添加劑對草魚生長性能和免疫保護力的影響[J]. 科學養(yǎng)魚，2009（12）：64-66.

[5]阮國良，楊代勤，王金龍.幾種中草藥飼料添加劑對黃鱔免疫功能和生長性能的影響[J]. 飼料工業(yè)，2005，26（24）：34-36.

[6]童圣英，趙 艷，李 宏，等. 幾種常用中草藥對皺紋盤鮑攝食行為的影響[J]. 大連水產(chǎn)學院學報，1998，12（4）：73-76.

[7]曾 虹，任澤林，郭 慶.大蒜素在羅非魚飼料中的應用[J]. 中國飼料，1996（21）：29-30.

[8]蔡中華，陳成勛，邢克智，等. 四種中藥對鯉魚非特異性免疫功能的影響[J]. 天津農(nóng)學院學報，1998，5（2）：31-34.

[9]崔青曼，張耀紅，袁春營.中草藥、多糖復方添加劑提高河蟹機體免疫力的研究[J]. 水利漁業(yè)，2001，21（4）：40-41.

[10]Sun Y X，Jin L J，Wang T T，et al. Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion（O2） production by coelomocytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology & Pharmacology，2008，147（3）：293-298.

[11]Ying J，Aardo L，Thompson K D，et al. Chinese herbs （Astragalus radix and Ganoderma lucidum） enhance immuneresponse of carp，Cyprinus carpio，and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish and Shellfish Immunology，2009，26（1）：140-145.

[12]李 超，張其中，楊瑩瑩，等. 不同劑量復方中草藥免疫增強劑對草魚生長性能和免疫功能的影響[J]. 上海海洋大學學報，2011，20（4）：534-540.endprint

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的GOT試劑盒測定。GOT能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移置換氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應過程中自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用產(chǎn)生2，4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境中顯棕色，比色后可得出其活性。定義：1 mL血清，反應液總?cè)萘? mL，340 nm波長，1 cm光徑，25 ℃，1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，將NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001為1個卡門氏單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理，采用一般線性模型進行比較以及單因素方差分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

由表1可知，6周后添加復方中草藥的飼料能使鯉魚的生長性能有所增強。但是，B1組的增重效果與B3組差異不顯著；B2組的增重率顯著高于其他3組（P<0.05），但其飼料系數(shù)顯著低于其他3組（P<0.05）。

3 結論與討論

3.1 復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

本試驗是按照醫(yī)學配伍的原則將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定比例配制的。結果表明，復方中草藥添加劑能夠提高試驗組鯉魚增重率，降低飼料系數(shù)，其中B2組效果較明顯，這一結果和許多學者的試驗結果一致。例如，齊遵利等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加黃芪、黃芩、大黃、大蒜能促進草魚的生長，降低飼料系數(shù)^[4]；阮國良等發(fā)現(xiàn)，五加皮、黃芪、茯苓及這3 種中藥的混合物均對黃鱔的增重有顯著的促進作用，且五加皮對黃鱔的增重最明顯^[5]；童圣英等發(fā)現(xiàn)，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有機酸，對皺紋盤鮑具有明顯的誘食作用^[6]；曾虹等在鯉魚餌料中添加11 mg/kg大蒜素，結果發(fā)現(xiàn)其可顯著提高鯉魚成活率2.6%、增重率14.3%，同時還能提高飼料轉(zhuǎn)化率11%^[7]。

3.2 復方中草藥添加劑對鯉魚非特異性免疫的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，在基礎飼料中添加不同劑量的復方中草藥提取物能提高草魚的免疫力和抗病力，表現(xiàn)為血清中CAT、LSZ、SOD活性均顯著高于對照組。各組的輔助免疫指標ACP、AKP、GOT活性差異不大，說明試驗采樣的動物基本生理指標差異不大，沒有在得病時被隨機取樣。蔡中華等用中藥大黃、黃連、花粉、無花果4種中草藥喂養(yǎng)鯉魚，結果發(fā)現(xiàn)，魚體免疫器官質(zhì)量增加，溶菌物質(zhì)的溶菌活性及吞噬能力增強，魚體特異性免疫能力顯著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等喂養(yǎng)河蟹，通過檢測河蟹的血細胞吞噬活性、血清凝集效價及血清殺菌活性等免疫學指標后證實，該添加劑可顯著提高河蟹機體的免疫功能^[9]。Sun等研究了黃芪多糖對仿刺參免疫的影響，結果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能促進仿刺參體腔細胞的吞噬能力^[10]。Ying等確認了黃芪和靈芝能提高鯉魚白細胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等將黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍根5味中草藥等比的水提取物分別按質(zhì)量分數(shù)1%、2%、4%、8%的比例添加到基礎飼料中飼喂草魚，結果顯示，各組草魚的LSZ、SOD活性均極顯著增強了^[12]。

綜合復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能和非特異性免疫指標的綜合比較得出，B2組鯉魚生長和非特異免疫性能均顯著強于其他3組。因此，在基礎飼料中添加0.2%復方中草藥添加劑效果最佳。

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[9]崔青曼，張耀紅，袁春營.中草藥、多糖復方添加劑提高河蟹機體免疫力的研究[J]. 水利漁業(yè)，2001，21（4）：40-41.

[10]Sun Y X，Jin L J，Wang T T，et al. Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion（O2） production by coelomocytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Toxicology & Pharmacology，2008，147（3）：293-298.

[11]Ying J，Aardo L，Thompson K D，et al. Chinese herbs （Astragalus radix and Ganoderma lucidum） enhance immuneresponse of carp，Cyprinus carpio，and protection against Aeromonas hydrophila[J]. Fish and Shellfish Immunology，2009，26（1）：140-145.

[12]李 超，張其中，楊瑩瑩，等. 不同劑量復方中草藥免疫增強劑對草魚生長性能和免疫功能的影響[J]. 上海海洋大學學報，2011，20（4）：534-540.endprint

采用南京建成生物工程研究中心生產(chǎn)的GOT試劑盒測定。GOT能使α-酮戊二酸和天門冬氨酸轉(zhuǎn)移置換氨基和丙酮，生成谷氨酸和草酰乙酸。草酰乙酸在反應過程中自行脫羧成丙酮酸。丙酮酸與2，4-二硝基苯肼作用產(chǎn)生2，4-二硝基苯腙，在堿性環(huán)境中顯棕色，比色后可得出其活性。定義：1 mL血清，反應液總?cè)萘? mL，340 nm波長，1 cm光徑，25 ℃，1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，將NaOH氧化成Na+而引起吸光度每下降0.001為1個卡門氏單位。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理，采用一般線性模型進行比較以及單因素方差分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

由表1可知，6周后添加復方中草藥的飼料能使鯉魚的生長性能有所增強。但是，B1組的增重效果與B3組差異不顯著；B2組的增重率顯著高于其他3組（P<0.05），但其飼料系數(shù)顯著低于其他3組（P<0.05）。

3 結論與討論

3.1 復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能的影響

本試驗是按照醫(yī)學配伍的原則將黃芪多糖、人參莖葉總皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5種中草藥提取物按照一定比例配制的。結果表明，復方中草藥添加劑能夠提高試驗組鯉魚增重率，降低飼料系數(shù)，其中B2組效果較明顯，這一結果和許多學者的試驗結果一致。例如，齊遵利等發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加黃芪、黃芩、大黃、大蒜能促進草魚的生長，降低飼料系數(shù)^[4]；阮國良等發(fā)現(xiàn)，五加皮、黃芪、茯苓及這3 種中藥的混合物均對黃鱔的增重有顯著的促進作用，且五加皮對黃鱔的增重最明顯^[5]；童圣英等發(fā)現(xiàn)，山奈（沙姜、山辣）中含有大量的有機酸，對皺紋盤鮑具有明顯的誘食作用^[6]；曾虹等在鯉魚餌料中添加11 mg/kg大蒜素，結果發(fā)現(xiàn)其可顯著提高鯉魚成活率2.6%、增重率14.3%，同時還能提高飼料轉(zhuǎn)化率11%^[7]。

3.2 復方中草藥添加劑對鯉魚非特異性免疫的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)，在基礎飼料中添加不同劑量的復方中草藥提取物能提高草魚的免疫力和抗病力，表現(xiàn)為血清中CAT、LSZ、SOD活性均顯著高于對照組。各組的輔助免疫指標ACP、AKP、GOT活性差異不大，說明試驗采樣的動物基本生理指標差異不大，沒有在得病時被隨機取樣。蔡中華等用中藥大黃、黃連、花粉、無花果4種中草藥喂養(yǎng)鯉魚，結果發(fā)現(xiàn)，魚體免疫器官質(zhì)量增加，溶菌物質(zhì)的溶菌活性及吞噬能力增強，魚體特異性免疫能力顯著提高^[8]。崔青曼等用海藻多糖、大黃、黃芪、連翹等喂養(yǎng)河蟹，通過檢測河蟹的血細胞吞噬活性、血清凝集效價及血清殺菌活性等免疫學指標后證實，該添加劑可顯著提高河蟹機體的免疫功能^[9]。Sun等研究了黃芪多糖對仿刺參免疫的影響，結果發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能促進仿刺參體腔細胞的吞噬能力^[10]。Ying等確認了黃芪和靈芝能提高鯉魚白細胞吞噬活性和血清溶菌活性^[11]。李超等將黃芪、大蒜、菊花、山楂和板藍根5味中草藥等比的水提取物分別按質(zhì)量分數(shù)1%、2%、4%、8%的比例添加到基礎飼料中飼喂草魚，結果顯示，各組草魚的LSZ、SOD活性均極顯著增強了^[12]。

綜合復方中草藥添加劑對鯉魚生長性能和非特異性免疫指標的綜合比較得出，B2組鯉魚生長和非特異免疫性能均顯著強于其他3組。因此，在基礎飼料中添加0.2%復方中草藥添加劑效果最佳。

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