鉬對(duì)小鼠睪丸NO含量及ATPase活性的影響

林霖+任洪濤+張才+李健+王宏偉+楊自軍

摘要：為探討鉬對(duì)小鼠睪丸NO含量及ATPase活性的影響，選用60只雄性昆明種小鼠，隨機(jī)分成對(duì)照組、鉬100組、鉬200組、鉬400組共4組，即飲水中分別添加0、100、200、400 mg/L鉬（鉬源為鉬酸鈉），連續(xù)染毒90 d，檢測(cè)小鼠睪丸組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，睪丸組織NO含量及ATP酶活性。結(jié)果表明，鉬染毒小鼠睪丸生精細(xì)胞變性，精子減少，睪丸組織NO含量升高，睪丸組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性下降，這可能是鉬導(dǎo)致雄性小鼠生殖障礙的毒性機(jī)制。

關(guān)鍵詞：鉬；睪丸；NO；ATP酶；小鼠

中圖分類號(hào)：S858.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0195-02

鉬是動(dòng)物必需的微量元素，是黃嘌呤氧化酶、醛氧化酶的重要組成成分，參與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及核酸代謝；鉬也是一種金屬毒物，當(dāng)過(guò)量的鉬進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體時(shí)，不僅會(huì)造成肝、腎等組織臟器損傷^[1-2]，還會(huì)影響動(dòng)物生殖系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能^[3]。本研究通過(guò)檢測(cè)鉬對(duì)小鼠睪丸組織ATP酶活性和NO含量的影響，為探討鉬對(duì)雄性小鼠生殖毒作用機(jī)制提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康昆明種雄性小白鼠60只，體重（16±1） g/只，由河南科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑 鉬酸鈉分析純，天津市化學(xué)試劑四廠生產(chǎn)；NO測(cè)試盒、總蛋白測(cè)試盒及ATP酶試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 健康昆明系雄性小白鼠60只，隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組、鉬100組、鉬200組和鉬400組，每組15只，分別飲用由鉬酸鈉配制、含鉬濃度為0、100、200、400 mg/L 去離子水。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由取食、飲水，染毒時(shí)間90 d。

1.2.2 睪丸組織切片制作、勻漿的制備及指標(biāo)檢測(cè) 染毒90 d后，各組取小鼠5只，頸椎脫臼處死；打開(kāi)腹腔，迅速摘取睪丸，去除外膜及血管，用4 ℃預(yù)冷生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分。睪丸一側(cè)用中性甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，光鏡檢測(cè)；另一側(cè)精確稱重，眼科剪剪碎，加冰浴生理鹽水，用玻璃勻漿器制成質(zhì)量濃度為10%的組織勻漿，冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，棄去沉淀，取上清液，置 -20 ℃ 冰箱中保存待測(cè)。嚴(yán)格按照試劑盒操作規(guī)程，測(cè)定睪丸組織液中NO含量以及Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活力，以1 h 1 mg蛋白分解ATP酶產(chǎn)生1 μmol的Pi量為1個(gè)ATP酶活力單位，即1 μmol/（mg·h）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用“x±s”表示，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采取單因素方差分析比較組間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉬對(duì)小鼠睪丸組織NO含量及ATP酶活性的影響

由表1可見(jiàn)，小鼠睪丸組織NO含量隨染毒劑量的增加而增加；鉬200組較對(duì)照組差異顯著（P<0.01），鉬400組較對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）；小鼠睪丸組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活力隨染毒劑量的增加，活性逐漸降低；鉬200組及鉬400組Na+-K+-ATP酶活性降低較對(duì)照組差異極顯著（P<0.01），鉬200組Ca2+-ATP酶的活力降低較對(duì)照組差異顯著（P<0.05），鉬400組Ca2+-ATP酶的活力降低較對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）。

Na+-K+-ATP酶為細(xì)胞膜上跨膜載體蛋白，能將細(xì)胞內(nèi)的Na+泵出細(xì)胞外，同時(shí)將細(xì)胞外的K+泵入細(xì)胞內(nèi)，Na+-K+-ATP 酶不僅能通過(guò)水解ATP為生命活動(dòng)提供能量，還對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮重要作用。Ca2+-ATP酶通過(guò)磷酸化和去磷酸化的變構(gòu)效應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外的Ca2+濃度，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)，對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)外電位平衡及細(xì)胞信使的傳遞有重要的生物學(xué)意義，還可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度，影響細(xì)胞內(nèi)DNA合成^[4]，從而影響組織細(xì)胞物質(zhì)交換及能量代謝。研究發(fā)現(xiàn)，多種重金屬物質(zhì)如鎘、鉛等可以通過(guò)抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活力來(lái)影響動(dòng)物的生殖功能^[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，鉬染毒小鼠睪丸組織中的Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活力下降，鉬可抑制雄性小鼠睪丸生精細(xì)胞和支持細(xì)胞物質(zhì)交換及能量代謝，引起小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致精子生成減少。

NO是機(jī)體內(nèi)的一種生物信號(hào)分子，同時(shí)還是一氣體類自由基，具有高度的活潑性和極強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力。內(nèi)源性NO由一氧化氮合酶催化L-精氨酸產(chǎn)生，生理范圍內(nèi)NO水平對(duì)機(jī)體是有益的；當(dāng)NO生成過(guò)多，會(huì)產(chǎn)生極強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，導(dǎo)致睪丸組織細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷^[6]，造成核酸、蛋白、糖類和脂質(zhì)等細(xì)胞成分損傷，從而導(dǎo)致能量代謝受到抑制，三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化和糖酵解受到干擾，影響精子的正常發(fā)生及獲能^[7]。Kai研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)多的自由基攻擊可直接破壞Na+-K+-ATP酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致Na+-K+-ATP酶活性下降，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+增多，從而激活細(xì)胞膜上的Na+-Ca2+交換蛋白，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多，Ca2+-ATP酶活性減弱，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，干擾線粒體氧化磷酸化反應(yīng)，ATP生成減少，加重細(xì)胞能量耗竭，ATP酶活性進(jìn)一步降低^[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，鉬染毒小鼠睪丸中的NO生成增多，并且隨著鉬染毒劑量的增加，睪丸組織NO含量也隨著增多，睪丸組織細(xì)胞損傷程度也越顯著，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果^[9]相一致。另外，高濃度的NO還可以通過(guò)cGMP介導(dǎo)作用抑制睪酮分泌^[10]，導(dǎo)致生精功能降低，這也可能是高劑量鉬影響雄性生殖功能的另一個(gè)途徑。endprint

綜上所述，鉬對(duì)睪丸的細(xì)胞毒作用存在NO毒作用機(jī)制，并可通過(guò)抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影響生殖功能。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖 杰，崔恒敏，楊 帆，等. 高鉬對(duì)雛雞腎臟的病理?yè)p傷和抗氧化功能的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（12）：1598-1604.

[2]周變?nèi)A，林 霖，楊自軍，等. 鉬對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及肝Smac和Bax表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（6）：617-621.

[3]張 才，郝貴增，王亞壘，等. 鉬對(duì)小鼠生殖毒性研究[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，33（3）：54-57.

[4]Jrgensen P L. Mechanism of the Na+，K+pump. Protein structure and conformations of the pure（Na++K+）-ATPase[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1982，694（1）：27-68.

[5]陳福欣，龔 頻，金 賽，等. 鎘損傷睪丸病理變化及藍(lán)莓花青素保護(hù)作用[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（3）：576-578.

[6]康友敏，張 健，李 健，等. 睪丸內(nèi)NO與NOS的研究進(jìn)展[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26（4）：301-304.

[7]張 威，張 瑋，倪 江. 一氧化氮對(duì)精子功能的影響[J]. 中華男科學(xué)，2000，6（4）：255-258.

[8]Kai Y X. Activition of Na+-K+-ATPase[J]. Biochemical and Biophysical Reseach Communication，2005，338：1669-1677.

[9]郭書周，楊自軍，張 才. 高鉬低銅對(duì)小鼠睪丸組織脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（11）：145-147，151.

[10]Valenti S，Cuttica C M，F(xiàn)azzuoli L，et al. Biphasic effect of nitric oxide on testosterone and cyclic GMP production by purified rat leydig cells cultured in vitro[J]. International Journal of Andrology，1999，22（5）：336-341.endprint

綜上所述，鉬對(duì)睪丸的細(xì)胞毒作用存在NO毒作用機(jī)制，并可通過(guò)抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影響生殖功能。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖 杰，崔恒敏，楊 帆，等. 高鉬對(duì)雛雞腎臟的病理?yè)p傷和抗氧化功能的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（12）：1598-1604.

[2]周變?nèi)A，林 霖，楊自軍，等. 鉬對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及肝Smac和Bax表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（6）：617-621.

[3]張 才，郝貴增，王亞壘，等. 鉬對(duì)小鼠生殖毒性研究[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，33（3）：54-57.

[4]Jrgensen P L. Mechanism of the Na+，K+pump. Protein structure and conformations of the pure（Na++K+）-ATPase[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1982，694（1）：27-68.

[5]陳福欣，龔 頻，金 賽，等. 鎘損傷睪丸病理變化及藍(lán)莓花青素保護(hù)作用[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（3）：576-578.

[6]康友敏，張 健，李 健，等. 睪丸內(nèi)NO與NOS的研究進(jìn)展[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26（4）：301-304.

[7]張 威，張 瑋，倪 江. 一氧化氮對(duì)精子功能的影響[J]. 中華男科學(xué)，2000，6（4）：255-258.

[8]Kai Y X. Activition of Na+-K+-ATPase[J]. Biochemical and Biophysical Reseach Communication，2005，338：1669-1677.

[9]郭書周，楊自軍，張 才. 高鉬低銅對(duì)小鼠睪丸組織脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（11）：145-147，151.

[10]Valenti S，Cuttica C M，F(xiàn)azzuoli L，et al. Biphasic effect of nitric oxide on testosterone and cyclic GMP production by purified rat leydig cells cultured in vitro[J]. International Journal of Andrology，1999，22（5）：336-341.endprint

綜上所述，鉬對(duì)睪丸的細(xì)胞毒作用存在NO毒作用機(jī)制，并可通過(guò)抑制Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶的活性影響生殖功能。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖 杰，崔恒敏，楊 帆，等. 高鉬對(duì)雛雞腎臟的病理?yè)p傷和抗氧化功能的影響[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（12）：1598-1604.

[2]周變?nèi)A，林 霖，楊自軍，等. 鉬對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化損傷及肝Smac和Bax表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，42（6）：617-621.

[3]張 才，郝貴增，王亞壘，等. 鉬對(duì)小鼠生殖毒性研究[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，33（3）：54-57.

[4]Jrgensen P L. Mechanism of the Na+，K+pump. Protein structure and conformations of the pure（Na++K+）-ATPase[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1982，694（1）：27-68.

[5]陳福欣，龔 頻，金 賽，等. 鎘損傷睪丸病理變化及藍(lán)莓花青素保護(hù)作用[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（3）：576-578.

[6]康友敏，張 健，李 健，等. 睪丸內(nèi)NO與NOS的研究進(jìn)展[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2002，26（4）：301-304.

[7]張 威，張 瑋，倪 江. 一氧化氮對(duì)精子功能的影響[J]. 中華男科學(xué)，2000，6（4）：255-258.

[8]Kai Y X. Activition of Na+-K+-ATPase[J]. Biochemical and Biophysical Reseach Communication，2005，338：1669-1677.

[9]郭書周，楊自軍，張 才. 高鉬低銅對(duì)小鼠睪丸組織脂質(zhì)過(guò)氧化作用的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（11）：145-147，151.

[10]Valenti S，Cuttica C M，F(xiàn)azzuoli L，et al. Biphasic effect of nitric oxide on testosterone and cyclic GMP production by purified rat leydig cells cultured in vitro[J]. International Journal of Andrology，1999，22（5）：336-341.endprint