5種常見食用菌液體發(fā)酵產(chǎn)物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

徐艷+王東華+紀(jì)明山

摘要：研究5種食用菌香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇液體發(fā)酵產(chǎn)物對黃瓜褐斑菌的抑制作用。通過母種試管活化培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)等一系列操作收集發(fā)酵產(chǎn)物，最后采用平板法研究各產(chǎn)物對黃瓜褐斑菌的抑制作用。結(jié)果表明，各菌種發(fā)酵液的抑菌活性明顯高于菌絲提取物。其中，以香菇、猴頭菇發(fā)酵液抑菌活性最好，抑制率達(dá)50%以上。猴頭菇發(fā)酵液的分離純化結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抑菌活性均好于原發(fā)酵液，其中乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最好。

關(guān)鍵詞：食用菌；液體發(fā)酵產(chǎn)物；平板法；黃瓜褐斑菌；抑菌作用

中圖分類號：S436.421.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0114-02

黃瓜是日常生活的主要蔬菜，隨著保護(hù)地黃瓜種植的發(fā)展，黃瓜褐斑病逐年加重，已成為保護(hù)地黃瓜生產(chǎn)中亟待解決的葉部病害。黃瓜褐斑病是由多主棒孢菌引起的世界性分布的病害。1994年房德純等報道了該病在遼寧省的發(fā)生情況，此后，黃瓜褐斑病在華北、西北的露地和保護(hù)地相繼發(fā)生^[1]。近年來，隨著黃瓜保護(hù)地種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，該病害蔓延趨勢明顯，尤其在2008年，全國各地黃瓜產(chǎn)區(qū)普遍有黃瓜褐斑病發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重地塊經(jīng)濟(jì)損失在20%以上。在黃瓜褐斑病的防治上，多以百菌清、甲基硫菌靈、福美雙等藥劑為主，這些常見藥劑作為預(yù)防藥劑，有病無病都在使用，致使褐斑病菌對其不再敏感，病害一旦在田間流行就很難控制，而且化學(xué)農(nóng)藥也會造成一定的環(huán)境污染，給人類生活和生存帶來不利的影響^[2]。目前，許多學(xué)者從天然植物中篩選農(nóng)藥取得了一定的進(jìn)展^[3-8]，但天然植物受資源限制嚴(yán)重，對生態(tài)環(huán)境有一定的破壞，而且開發(fā)成本較高。我國藥食用真菌資源豐富，無毒副作用，從中尋找抑制植物病原菌的活性物質(zhì)，研制新型殺菌劑以防治植物病害，對栽種符合健康標(biāo)準(zhǔn)的蔬菜具有重要意義。一方面，從藥食用真菌中不斷發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎和具有顯著生物活性的化合物，這種結(jié)構(gòu)多樣性對于新農(nóng)藥的發(fā)現(xiàn)有重要意義；另一方面，大型藥食用真菌可以較方便地通過菌絲體或孢子發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的工業(yè)化、規(guī)?；?，產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效益高。這為今后可能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了資源保證，相對于受資源限制的植物源農(nóng)藥而言，這是一個潛在的優(yōu)勢^[9]。本研究通過平板法，以香菇（Lentinula edodes）、杏鮑菇（Pleurotus eryngii）、金針菇（Flammulina velutipes）、猴頭菇（Hericium erinaceus）、雞腿菇（Coprinus comaus）等幾種常見食用真菌發(fā)酵產(chǎn)物為研究對象，分別對黃瓜褐斑菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，進(jìn)而通過生長速率法分別計算各個菌種發(fā)酵產(chǎn)物對黃瓜褐斑病菌的抑菌率。結(jié)果表明，發(fā)酵液的抑菌活性明顯高于菌絲提取物。其中，以香菇、猴頭菇發(fā)酵液抑菌活性最好，抑制率達(dá)50%以上。猴頭菇發(fā)酵液的分離純化結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取物抑菌活性最好。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

香菇、杏鮑、金針菇、猴頭菇和雞腿菇等供試菌株均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；黃瓜褐斑菌由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試驗(yàn)儀器

恒溫電熱水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電子分析天平、恒溫振蕩箱、超凈工作臺、電動粉碎機(jī)、電冰箱。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

PDA固體培養(yǎng)基含馬鈴薯 200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，水1 000 mL。不同菌種的種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基如下。

1.3.1.1 香菇

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1.5 g。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉 40 g，酵母膏3 g，蔗糖25 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1 g，維生素B1 0.05 g，pH值5.25。

1.3.1.2 杏鮑菇

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，麥麩40 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1.5 g。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉 30 g，麥麩20 g，酵母膏3 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g。

1.3.1.3 金針菇

種子培養(yǎng)基：玉米粉50 g，麥麩30 g，酵母膏10 g，蔗糖4 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，維生素B1 0.1 g。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉30 g，可溶性淀粉20 g，麥麩30 g，蛋白胨10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，維生素B1 0.1 g。

1.3.1.4 猴頭菇

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1 g，KH2PO4 2 g，MgSO4 1 g，維生素B1 0.1 g，pH值6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉25 g，酵母膏25 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 1 g，維生素B1 0.1 g，pH值5.0。

1.3.1.5 雞腿菇

種子培養(yǎng)基：蔗糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.05 g，維生素B1 0.01 g。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20 g，酵母粉5 g，麥麩40 g，玉米粉30 g，KH2PO4 3 g，MgSO4 1 g。培養(yǎng)基每瓶100 mL分裝于三角瓶中進(jìn)行高壓滅菌，121 ℃滅菌20 min后置于超凈臺冷卻備用。

1.3.2 菌種的發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子液按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在27 ℃搖床中培養(yǎng)，待菌絲生長成熟后結(jié)束發(fā)酵。

1.3.3 各菌種代謝產(chǎn)物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

1.3.3.1 菌絲活性成分的提取

收集菌絲，水洗后低溫干燥。菌絲加水后超聲提取，收集提取液。

1.3.3.2 培養(yǎng)基平板的制備

采用平板法測定各發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性。將滅菌的9 cm直徑平皿分為2組，一組為空白對照，一組為加樣組。各組均加入10 mL PDA培養(yǎng)基，隨后加樣組中加入5 mL 發(fā)酵液混勻，空白對照組中則加入5 mL 無菌水混勻，靜置數(shù)分鐘待培養(yǎng)基冷凝備用。

1.3.3.3 黃瓜褐斑菌的接種與培養(yǎng)

用已滅菌的打孔器（直徑為10 mm）取已活化好的黃瓜褐斑菌餅，小心放入所有制備好的培養(yǎng)基平板中心（確保褐斑菌能均勻的向四周生長）。接種完成后用封口膜將平皿密封好，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，28 ℃培養(yǎng) 7 d后觀察結(jié)果。以上操作均在無菌條件下完成。

1.3.4 生長速率法測定抑菌率

待菌落生長一定時間后用十字交叉法測量黃瓜褐斑菌菌落的直徑，菌落生長直徑（mm）采用3次測量菌落直徑平均值，并用下述公式計算抑菌率：

1.3.5 猴頭菇發(fā)酵液的分離純化

將猴頭菇發(fā)酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別對發(fā)酵液樣品進(jìn)行萃取，每種萃取液重復(fù)萃取2 次，分別合并萃取液，將其濃縮，放置在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌種發(fā)酵產(chǎn)物抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲提取物幾乎沒有抑制作用，幾種真菌發(fā)酵液對黃瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培養(yǎng)數(shù)天后菌落的菌斑大小各有不同，表1結(jié)果表明，香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇這5種常見的食用真菌發(fā)酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴頭菇的抑菌率最高，分別為58.8%和60.0%；杏鮑菇和金針菇次之，分別為45.9%和38.8%；雞腿菇的抑菌率最低，僅為29.4%。

3 結(jié)論

本研究所選用的5種真菌均為常見的食用真菌，其發(fā)酵方法已較成熟，但其對植物病原生長的抑制活性鮮有報道。本研究結(jié)果證明了這5種食用真菌發(fā)酵液有一定的抑制黃瓜褐斑菌的活性，由于發(fā)酵液只進(jìn)行了初步純化，有必要繼續(xù)對發(fā)酵液的活性物質(zhì)進(jìn)行研究。研究中所提取的各種活性物質(zhì)對人、動物和環(huán)境沒有任何影響，是理想的生物農(nóng)藥前導(dǎo)物，有較大的開發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)：

[1]房德純，傅俊范. 黃瓜褐斑病病原與發(fā)病情況調(diào)查研究初報[J]. 植物保護(hù)，1994，20（3）：23-24.

[2]許 遠(yuǎn)，張子君，鄒慶道，等. 黃瓜褐斑病的藥劑防治研究[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，31（6）：47-48.

[3]Eduardo O，Mariano F，Daniel H，et al.Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum） and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.） against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2010，31（1）：153-157.

[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波輔助提取香榧假種皮揮發(fā)油及其對植物病原真菌的抑制活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：309-311.

[5]Mahlo S M，Mcgaw L J，Eloff J N. Antifungal activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens[J]. Crop Protection，2010，29（12）：1529-1533.

[6]劉紹雄，王金華，熊 智，等. 青蒿乙醇提取物對5齡思茅松毛蟲腸道細(xì)菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：141-142.

[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.

[8]吳雪平，田雪亮，項(xiàng)志鋒. 蓖麻籽水提物對黃瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15（6）：215-216.

[9]楊民寶. 銹革孔菌科三種真菌對植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2009：1.

1.3.3 各菌種代謝產(chǎn)物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

1.3.3.1 菌絲活性成分的提取

收集菌絲，水洗后低溫干燥。菌絲加水后超聲提取，收集提取液。

1.3.3.2 培養(yǎng)基平板的制備

采用平板法測定各發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性。將滅菌的9 cm直徑平皿分為2組，一組為空白對照，一組為加樣組。各組均加入10 mL PDA培養(yǎng)基，隨后加樣組中加入5 mL 發(fā)酵液混勻，空白對照組中則加入5 mL 無菌水混勻，靜置數(shù)分鐘待培養(yǎng)基冷凝備用。

1.3.3.3 黃瓜褐斑菌的接種與培養(yǎng)

用已滅菌的打孔器（直徑為10 mm）取已活化好的黃瓜褐斑菌餅，小心放入所有制備好的培養(yǎng)基平板中心（確保褐斑菌能均勻的向四周生長）。接種完成后用封口膜將平皿密封好，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，28 ℃培養(yǎng) 7 d后觀察結(jié)果。以上操作均在無菌條件下完成。

1.3.4 生長速率法測定抑菌率

待菌落生長一定時間后用十字交叉法測量黃瓜褐斑菌菌落的直徑，菌落生長直徑（mm）采用3次測量菌落直徑平均值，并用下述公式計算抑菌率：

1.3.5 猴頭菇發(fā)酵液的分離純化

將猴頭菇發(fā)酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別對發(fā)酵液樣品進(jìn)行萃取，每種萃取液重復(fù)萃取2 次，分別合并萃取液，將其濃縮，放置在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌種發(fā)酵產(chǎn)物抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲提取物幾乎沒有抑制作用，幾種真菌發(fā)酵液對黃瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培養(yǎng)數(shù)天后菌落的菌斑大小各有不同，表1結(jié)果表明，香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇這5種常見的食用真菌發(fā)酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴頭菇的抑菌率最高，分別為58.8%和60.0%；杏鮑菇和金針菇次之，分別為45.9%和38.8%；雞腿菇的抑菌率最低，僅為29.4%。

3 結(jié)論

本研究所選用的5種真菌均為常見的食用真菌，其發(fā)酵方法已較成熟，但其對植物病原生長的抑制活性鮮有報道。本研究結(jié)果證明了這5種食用真菌發(fā)酵液有一定的抑制黃瓜褐斑菌的活性，由于發(fā)酵液只進(jìn)行了初步純化，有必要繼續(xù)對發(fā)酵液的活性物質(zhì)進(jìn)行研究。研究中所提取的各種活性物質(zhì)對人、動物和環(huán)境沒有任何影響，是理想的生物農(nóng)藥前導(dǎo)物，有較大的開發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)：

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[2]許 遠(yuǎn)，張子君，鄒慶道，等. 黃瓜褐斑病的藥劑防治研究[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，31（6）：47-48.

[3]Eduardo O，Mariano F，Daniel H，et al.Biological efficiency of polyphenolic extracts from pecan nuts shell（Carya illinoensis），pomegranate husk（Punica granatum） and creosote bush leaves（Larrea tridentata Cov.） against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2010，31（1）：153-157.

[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波輔助提取香榧假種皮揮發(fā)油及其對植物病原真菌的抑制活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：309-311.

[5]Mahlo S M，Mcgaw L J，Eloff J N. Antifungal activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens[J]. Crop Protection，2010，29（12）：1529-1533.

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[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.

[8]吳雪平，田雪亮，項(xiàng)志鋒. 蓖麻籽水提物對黃瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15（6）：215-216.

[9]楊民寶. 銹革孔菌科三種真菌對植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2009：1.

1.3.3 各菌種代謝產(chǎn)物對黃瓜褐斑菌的抑制作用

1.3.3.1 菌絲活性成分的提取

收集菌絲，水洗后低溫干燥。菌絲加水后超聲提取，收集提取液。

1.3.3.2 培養(yǎng)基平板的制備

采用平板法測定各發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌活性。將滅菌的9 cm直徑平皿分為2組，一組為空白對照，一組為加樣組。各組均加入10 mL PDA培養(yǎng)基，隨后加樣組中加入5 mL 發(fā)酵液混勻，空白對照組中則加入5 mL 無菌水混勻，靜置數(shù)分鐘待培養(yǎng)基冷凝備用。

1.3.3.3 黃瓜褐斑菌的接種與培養(yǎng)

用已滅菌的打孔器（直徑為10 mm）取已活化好的黃瓜褐斑菌餅，小心放入所有制備好的培養(yǎng)基平板中心（確保褐斑菌能均勻的向四周生長）。接種完成后用封口膜將平皿密封好，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，28 ℃培養(yǎng) 7 d后觀察結(jié)果。以上操作均在無菌條件下完成。

1.3.4 生長速率法測定抑菌率

待菌落生長一定時間后用十字交叉法測量黃瓜褐斑菌菌落的直徑，菌落生長直徑（mm）采用3次測量菌落直徑平均值，并用下述公式計算抑菌率：

1.3.5 猴頭菇發(fā)酵液的分離純化

將猴頭菇發(fā)酵液放入分液漏斗中，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別對發(fā)酵液樣品進(jìn)行萃取，每種萃取液重復(fù)萃取2 次，分別合并萃取液，將其濃縮，放置在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌種發(fā)酵產(chǎn)物抑菌試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲提取物幾乎沒有抑制作用，幾種真菌發(fā)酵液對黃瓜褐斑菌都有不同程度的抑制作用，培養(yǎng)數(shù)天后菌落的菌斑大小各有不同，表1結(jié)果表明，香菇、杏鮑菇、金針菇、猴頭菇、雞腿菇這5種常見的食用真菌發(fā)酵液均具有不同程度的抑菌效果。其中，香菇和猴頭菇的抑菌率最高，分別為58.8%和60.0%；杏鮑菇和金針菇次之，分別為45.9%和38.8%；雞腿菇的抑菌率最低，僅為29.4%。

3 結(jié)論

本研究所選用的5種真菌均為常見的食用真菌，其發(fā)酵方法已較成熟，但其對植物病原生長的抑制活性鮮有報道。本研究結(jié)果證明了這5種食用真菌發(fā)酵液有一定的抑制黃瓜褐斑菌的活性，由于發(fā)酵液只進(jìn)行了初步純化，有必要繼續(xù)對發(fā)酵液的活性物質(zhì)進(jìn)行研究。研究中所提取的各種活性物質(zhì)對人、動物和環(huán)境沒有任何影響，是理想的生物農(nóng)藥前導(dǎo)物，有較大的開發(fā)前景。

參考文獻(xiàn)：

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[2]許 遠(yuǎn)，張子君，鄒慶道，等. 黃瓜褐斑病的藥劑防治研究[J]. 遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，31（6）：47-48.

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[4]朱巧萍，高雪平，程 璐，等. 微波輔助提取香榧假種皮揮發(fā)油及其對植物病原真菌的抑制活性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：309-311.

[5]Mahlo S M，Mcgaw L J，Eloff J N. Antifungal activity of leaf extracts from South African trees against plant pathogens[J]. Crop Protection，2010，29（12）：1529-1533.

[6]劉紹雄，王金華，熊 智，等. 青蒿乙醇提取物對5齡思茅松毛蟲腸道細(xì)菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（4）：141-142.

[7]de Rodríguez D J，Hernández-Castillo D，Rodríguez-García R，et al. Antifungal activity in vitro of aloe vera pulp and liquid fraction against plant pathogenic fungi[J]. Industrial Crops and Products，2005，21（1）：81-87.

[8]吳雪平，田雪亮，項(xiàng)志鋒. 蓖麻籽水提物對黃瓜褐斑病菌的生物活性研究[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15（6）：215-216.

[9]楊民寶. 銹革孔菌科三種真菌對植物病原菌抑制作用的研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2009：1.