肉制品中驢源性成分PCR方法的建立及應(yīng)用

郭鳳柳+熊蕊+劉曉慧+趙同欣+王娜+顏紅

摘要：建立了驢源性成分的快速分子檢測方法，確立了1對驢源性成分的特異性引物HorseF/HorseR，擴(kuò)增目的片段的長度是294 bp，經(jīng)驗(yàn)證引物對驢源性成分的特異性良好，確立了PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)體系和最優(yōu)反應(yīng)條件。反應(yīng)體系的檢測靈敏度是13.7 pg/μL。擴(kuò)增片段經(jīng)AluⅠ酶切分析確認(rèn)，所得181、113 bp片段與分析結(jié)果一致。利用該方法對市售樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：驢源性成分；檢測；PCR反應(yīng)；肉品貿(mào)易；造假檢測

中圖分類號：S851.34 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0035-04

隨著人們生活水平的提高，對肉的要求也越來越高，而目前國內(nèi)市場上在肉和肉制品的生產(chǎn)與銷售中，一些不法商家或個人利用摻雜摻假、以次充好等手段欺騙消費(fèi)者以牟取暴利的事件屢屢出現(xiàn)。我國食品工業(yè)飛速發(fā)展，食品摻假方式越來越多，范圍越來越廣，內(nèi)容越來越復(fù)雜。一些不法商家或個人為了追求自身利益以低價(jià)、劣質(zhì)肉冒充高價(jià)、優(yōu)質(zhì)肉^[1]，如用雞肉冒充豬肉，用豬肉、鴨肉冒充牛肉、羊肉等造假行為最為常見。這不僅涉及經(jīng)濟(jì)、營養(yǎng)價(jià)值和食品安全等問題，更直接影響消費(fèi)者健康。此外，在清真食品中摻雜豬肉等行為還涉及宗教信仰等問題。因此，對食品中原料肉進(jìn)行摻假、摻雜檢驗(yàn)十分必要，其重點(diǎn)就是快速、準(zhǔn)確鑒定肉制品品種。

保定驢肉火燒是著名小吃，和“保定三寶”并駕齊驅(qū)。驢肉中富含人體必需的氨基酸和脂肪酸，是一種高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)食物。此外，驢肉中礦物元素鐵含量高于其他畜禽肉，其食用價(jià)值高、營養(yǎng)豐富、味道鮮美，值得大力開發(fā)研究和推廣^[2]。也是由于上述原因，驢肉在人們?nèi)粘Ｉ钪械男枨罅吭絹碓酱螅瑑r(jià)格越來越高，致使其摻假問題也越來越普遍，因此肉種類鑒定是食品分析的一個重要方面。PCR技術(shù)是食品中肉類成分鑒別的主流技術(shù)，研究對象集中在市場上常見的羊肉、牛肉、豬肉、雞肉上，目前還沒有關(guān)于驢源性成分PCR檢測方法的報(bào)道。本研究合成了1對用于檢測驢源性成分的特異性引物，通過對反應(yīng)體系的摸索及反應(yīng)條件的優(yōu)化，驗(yàn)證了該方法的特異性與靈敏度，建立了鑒定驢源性成分的PCR技術(shù)，旨在為杜絕食品貿(mào)易中的欺騙行為提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

蛋白酶K、RNA酶、dNTPs、10×PCR緩沖液、MgCl2、Taq DNA聚合酶、2 000 bp ladder DNA marker、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒以及血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒等均購自北京天根生化科技有限公司；Sau3AⅠ、AluⅠ限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程有限公司。引物合成及序列測定均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

試驗(yàn)儀器：進(jìn)口ABI梯度PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像儀及電泳系統(tǒng)、sigma臺式離心機(jī)。

1.2 PCR引物

合成1對特異性引物，用高壓滅菌后的超純水溶解，配制成100 mol/L的儲備液。引物序列：上游引物序列為5′-TGCCACAGTTGGATACATCAAC-3′；下游引物序列為5′-ATTGAGATTAGGCGATTGTT-3′；擴(kuò)增目的條帶長294 bp。

1.3 樣本總DNA的提取

驢肉基因組DNA提取根據(jù)血液、細(xì)胞、組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。取適量基因組DNA在紫外分光光度計(jì)下檢測其濃度和純度。當(dāng)D260 nm/D280 nm為1.7～1.9時(shí)，DNA純度才適宜進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.4 目的條帶擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液（Mg2+ free）5 μL，25 mmol/L MgCl2 3 μL，2.5 mmol/L 4×dNTPs 4 μL，引物HorseF和HorseR（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板10 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.3 μL，補(bǔ)足無菌超純水到25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性60 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。結(jié)束后4 ℃保存。

PCR結(jié)束后用2%瓊脂糖凝膠，TAE電泳緩沖系統(tǒng)，9 V/cm 恒壓電泳，2 000 bp ladder作為分子量對照對目的條帶進(jìn)行檢測。

1.5 目的條帶Sau3AⅠ、AluⅠ的酶切鑒定及測序

由于目的條帶可能是馬源性成分，因此對擴(kuò)增產(chǎn)物要用馬源性成分的限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ進(jìn)行酶切，片段大小分別是226、68 bp。驢源性成分的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AluⅠ進(jìn)行酶切，片段大小分別是113、181 bp。

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，將其進(jìn)行酶切反應(yīng)，體系為：Sau3AⅠ/AluⅠ1 μL，10×H Buffer 5 μL，PCR回收產(chǎn)物20 μL，用無菌ddH2O補(bǔ)足到50 μL。將反應(yīng)體系配制好后放入37 ℃溫浴1 h后65 ℃溫浴5 min終止反應(yīng)，酶切產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

將回收的目的條帶交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定，序列校對后，在GenBank中進(jìn)行Blastn比對分析，驗(yàn)證所得片段。

1.6 檢測體系的靈敏度、特異性檢測

1.6.1 靈敏性檢測

將熟驢肉的DNA模板依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，直到10-6，每個稀釋度各取2 μL作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對照、陽性對照，電泳檢測。

1.6.2 特異性檢測

取已制備的牛、羊、狗、兔、羊、鴨等15種動物肉的DNA各0.1 μg作為模板，加入體系中進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陽性對照及空白對照，電泳檢測。

1.7 市售肉制品檢測

購置市售驢肉火燒、驢肉大餅和真空袋包裝的驢肉樣品，提取其DNA，用已建立的檢測方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取和引物擴(kuò)增結(jié)果

對熟驢肉提取的基因組DNA的D260 nm/D280 nm值均為 1.7～1.9，說明質(zhì)量較好，可以用于下游試驗(yàn)操作。引物對驢肉的基因組DNA擴(kuò)增出了目的條帶（圖1），目的條帶回收后的酶切效果也較好（圖2），得到了181、113 bp的條帶。擴(kuò)增的目的片段測序結(jié)果經(jīng)校對后，在NCBI中經(jīng) Blastn分析，結(jié)果表明該片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Equus asinus（家驢）的相似性是100%，與Equus hemionus（野驢）等基因序列的相似性大于95 %，證明所得片段為目的片段。

2.2 PCR反應(yīng)的靈敏度

驢肉提取的DNA濃度是68.5 ng/μL，將提取的DNA進(jìn)行10～106倍梯度稀釋后，如圖4所示，在模板稀釋104倍后再未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，因此反應(yīng)體系的靈敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反應(yīng)的特異性

引物對驢肉的基因組DNA擴(kuò)增出了目的條帶。如圖5所示，引物對其他動物的DNA沒有擴(kuò)增出條帶，但是對羊、狗的基因組也擴(kuò)增出了相似條帶。如圖6所示，進(jìn)一步進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果沒有得到正確的酶切結(jié)果，表明引物的特異性較高。

3 結(jié)論與討論

肉類檢測方法有多種多樣，其中ELISA技術(shù)應(yīng)用較多，ELISA技術(shù)是將抗原、抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種免疫分析方法^[3]，但是該方法有一定的局限性：首先要有足夠的抗體供檢測分析；其次肉類食品在加工過程中經(jīng)過加熱、高壓、輻射等處理，蛋白遭到破壞，不適合用ELISA方法檢測。DNA分子分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，作為遺傳信息的載體，分子結(jié)構(gòu)中攜帶了豐富的種源特異性信息^[4]，DNA檢測是目前物種鑒定的最有效手段^[5-8]。DNA鑒定主要是通過PCR反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。目前還沒有驢肉檢測方法，一般是憑色澤、紋理等簡單方法進(jìn)行辨認(rèn)，因此需要找到具有說服力的檢測方法。本研究使用的PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快。

肉類產(chǎn)品放置1、2、9、16 d后，DNA片段會由3萬bp降解到1.6萬bp。加熱到80 ℃，DNA片段長度不受影響，而達(dá)到100 ℃則DNA長度銳減至1 100 bp，加熱至120 ℃減至600 bp以下。市售驢肉多經(jīng)過高壓處理，因此本研究中選擇294 bp的短片段，這樣即使經(jīng)過高壓處理，肉中模板DNA也不被破壞而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

引物是根據(jù)驢肉線粒體DNA設(shè)計(jì)合成的，因此具有高度的特異性，本研究表明，引物對其他動物的基因組DNA沒有擴(kuò)增到可以酶切到目的片段的PCR產(chǎn)物，因此該檢測技術(shù)具有高度的特異性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉帥帥，李 宏，羅世芝，等. PCR技術(shù)在肉類摻假檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2011，2（6）：280-284.

[2]尤 娟，羅永康，張巖春，等. 驢肉主要營養(yǎng)成分及與其它畜禽肉的分析比較[J]. 肉類研究，2008（7）：20-22.

[3]張占軍，王富花. 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：157-160.

[4]Fajardo V，Gonzalez I，Rojas M，et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology，2010，21（8）：408-421.

[5]王 薇，王利麗，熊莉麗，等. ITS序列作為DNA條形碼在蟲草鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中的研究與應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（3）：680-682.

[6]Aida A A，Man Y B，Wong C M，et al. Analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for halal authentication[J]. Meat Science，2005，69（1）：47-52.

[7]田慧敏，劉鐵志. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在紅菇分子鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：28-31.

[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.

1.7 市售肉制品檢測

購置市售驢肉火燒、驢肉大餅和真空袋包裝的驢肉樣品，提取其DNA，用已建立的檢測方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取和引物擴(kuò)增結(jié)果

對熟驢肉提取的基因組DNA的D260 nm/D280 nm值均為 1.7～1.9，說明質(zhì)量較好，可以用于下游試驗(yàn)操作。引物對驢肉的基因組DNA擴(kuò)增出了目的條帶（圖1），目的條帶回收后的酶切效果也較好（圖2），得到了181、113 bp的條帶。擴(kuò)增的目的片段測序結(jié)果經(jīng)校對后，在NCBI中經(jīng) Blastn分析，結(jié)果表明該片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Equus asinus（家驢）的相似性是100%，與Equus hemionus（野驢）等基因序列的相似性大于95 %，證明所得片段為目的片段。

2.2 PCR反應(yīng)的靈敏度

驢肉提取的DNA濃度是68.5 ng/μL，將提取的DNA進(jìn)行10～106倍梯度稀釋后，如圖4所示，在模板稀釋104倍后再未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，因此反應(yīng)體系的靈敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反應(yīng)的特異性

引物對驢肉的基因組DNA擴(kuò)增出了目的條帶。如圖5所示，引物對其他動物的DNA沒有擴(kuò)增出條帶，但是對羊、狗的基因組也擴(kuò)增出了相似條帶。如圖6所示，進(jìn)一步進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果沒有得到正確的酶切結(jié)果，表明引物的特異性較高。

3 結(jié)論與討論

肉類檢測方法有多種多樣，其中ELISA技術(shù)應(yīng)用較多，ELISA技術(shù)是將抗原、抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種免疫分析方法^[3]，但是該方法有一定的局限性：首先要有足夠的抗體供檢測分析；其次肉類食品在加工過程中經(jīng)過加熱、高壓、輻射等處理，蛋白遭到破壞，不適合用ELISA方法檢測。DNA分子分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，作為遺傳信息的載體，分子結(jié)構(gòu)中攜帶了豐富的種源特異性信息^[4]，DNA檢測是目前物種鑒定的最有效手段^[5-8]。DNA鑒定主要是通過PCR反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。目前還沒有驢肉檢測方法，一般是憑色澤、紋理等簡單方法進(jìn)行辨認(rèn)，因此需要找到具有說服力的檢測方法。本研究使用的PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快。

肉類產(chǎn)品放置1、2、9、16 d后，DNA片段會由3萬bp降解到1.6萬bp。加熱到80 ℃，DNA片段長度不受影響，而達(dá)到100 ℃則DNA長度銳減至1 100 bp，加熱至120 ℃減至600 bp以下。市售驢肉多經(jīng)過高壓處理，因此本研究中選擇294 bp的短片段，這樣即使經(jīng)過高壓處理，肉中模板DNA也不被破壞而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

引物是根據(jù)驢肉線粒體DNA設(shè)計(jì)合成的，因此具有高度的特異性，本研究表明，引物對其他動物的基因組DNA沒有擴(kuò)增到可以酶切到目的片段的PCR產(chǎn)物，因此該檢測技術(shù)具有高度的特異性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉帥帥，李 宏，羅世芝，等. PCR技術(shù)在肉類摻假檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2011，2（6）：280-284.

[2]尤 娟，羅永康，張巖春，等. 驢肉主要營養(yǎng)成分及與其它畜禽肉的分析比較[J]. 肉類研究，2008（7）：20-22.

[3]張占軍，王富花. 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：157-160.

[4]Fajardo V，Gonzalez I，Rojas M，et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology，2010，21（8）：408-421.

[5]王 薇，王利麗，熊莉麗，等. ITS序列作為DNA條形碼在蟲草鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中的研究與應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（3）：680-682.

[6]Aida A A，Man Y B，Wong C M，et al. Analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for halal authentication[J]. Meat Science，2005，69（1）：47-52.

[7]田慧敏，劉鐵志. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在紅菇分子鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：28-31.

[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.

1.7 市售肉制品檢測

購置市售驢肉火燒、驢肉大餅和真空袋包裝的驢肉樣品，提取其DNA，用已建立的檢測方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取和引物擴(kuò)增結(jié)果

對熟驢肉提取的基因組DNA的D260 nm/D280 nm值均為 1.7～1.9，說明質(zhì)量較好，可以用于下游試驗(yàn)操作。引物對驢肉的基因組DNA擴(kuò)增出了目的條帶（圖1），目的條帶回收后的酶切效果也較好（圖2），得到了181、113 bp的條帶。擴(kuò)增的目的片段測序結(jié)果經(jīng)校對后，在NCBI中經(jīng) Blastn分析，結(jié)果表明該片段的核苷酸序列與GenBank中已登記的Equus asinus（家驢）的相似性是100%，與Equus hemionus（野驢）等基因序列的相似性大于95 %，證明所得片段為目的片段。

2.2 PCR反應(yīng)的靈敏度

驢肉提取的DNA濃度是68.5 ng/μL，將提取的DNA進(jìn)行10～106倍梯度稀釋后，如圖4所示，在模板稀釋104倍后再未出現(xiàn)反應(yīng)條帶，因此反應(yīng)體系的靈敏度是 13.7 pg/μL。

2.3 PCR反應(yīng)的特異性

引物對驢肉的基因組DNA擴(kuò)增出了目的條帶。如圖5所示，引物對其他動物的DNA沒有擴(kuò)增出條帶，但是對羊、狗的基因組也擴(kuò)增出了相似條帶。如圖6所示，進(jìn)一步進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果沒有得到正確的酶切結(jié)果，表明引物的特異性較高。

3 結(jié)論與討論

肉類檢測方法有多種多樣，其中ELISA技術(shù)應(yīng)用較多，ELISA技術(shù)是將抗原、抗體反應(yīng)的高度特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合發(fā)展建立的一種免疫分析方法^[3]，但是該方法有一定的局限性：首先要有足夠的抗體供檢測分析；其次肉類食品在加工過程中經(jīng)過加熱、高壓、輻射等處理，蛋白遭到破壞，不適合用ELISA方法檢測。DNA分子分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，作為遺傳信息的載體，分子結(jié)構(gòu)中攜帶了豐富的種源特異性信息^[4]，DNA檢測是目前物種鑒定的最有效手段^[5-8]。DNA鑒定主要是通過PCR反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。目前還沒有驢肉檢測方法，一般是憑色澤、紋理等簡單方法進(jìn)行辨認(rèn)，因此需要找到具有說服力的檢測方法。本研究使用的PCR方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快。

肉類產(chǎn)品放置1、2、9、16 d后，DNA片段會由3萬bp降解到1.6萬bp。加熱到80 ℃，DNA片段長度不受影響，而達(dá)到100 ℃則DNA長度銳減至1 100 bp，加熱至120 ℃減至600 bp以下。市售驢肉多經(jīng)過高壓處理，因此本研究中選擇294 bp的短片段，這樣即使經(jīng)過高壓處理，肉中模板DNA也不被破壞而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

引物是根據(jù)驢肉線粒體DNA設(shè)計(jì)合成的，因此具有高度的特異性，本研究表明，引物對其他動物的基因組DNA沒有擴(kuò)增到可以酶切到目的片段的PCR產(chǎn)物，因此該檢測技術(shù)具有高度的特異性。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉帥帥，李 宏，羅世芝，等. PCR技術(shù)在肉類摻假檢驗(yàn)中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2011，2（6）：280-284.

[2]尤 娟，羅永康，張巖春，等. 驢肉主要營養(yǎng)成分及與其它畜禽肉的分析比較[J]. 肉類研究，2008（7）：20-22.

[3]張占軍，王富花. 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用[J]. 食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：157-160.

[4]Fajardo V，Gonzalez I，Rojas M，et al. A review of current PCR-based methodologies for the authentication of meats from game animal species[J]. Trends in Food Science & Technology，2010，21（8）：408-421.

[5]王 薇，王利麗，熊莉麗，等. ITS序列作為DNA條形碼在蟲草鑒定及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中的研究與應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，28（3）：680-682.

[6]Aida A A，Man Y B，Wong C M，et al. Analysis of raw meats and fats of pigs using polymerase chain reaction for halal authentication[J]. Meat Science，2005，69（1）：47-52.

[7]田慧敏，劉鐵志. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在紅菇分子鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（4）：28-31.

[8]Lockley A K，Bardsley R G. DNA-based methods for food authentication[J]. Trends in Food Science & Technology，2000，11（2）：67-77.