野牛草基因組DNA提取方法的篩選

張曉波+許沛東+趙艷

摘要：采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、十二烷基磺酸鈉（SDS）法以及高鹽法3種方法對野牛草葉片的基因組DNA進行提取，并利用分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測比較3種方法提取DNA的純度與濃度。結果表明，3種方法提取到的野牛草葉片DNA的純度、完整性都較好，質量從高到低依次為CTAB法>高鹽法>SDS法，產率依次為SDS法>CTAB法>高鹽法，綜合來看CTAB法是提取野牛草基因組DNA的最佳方法。

關鍵詞：野牛草；DNA提?。籆TAB法；SDS法；高鹽法

中圖分類號：S688.403 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0026-03

野牛草是廣泛種植于我國西北、華北及東北地區(qū)的暖季型草坪草，在20世紀50年代初由中科院胡淑良先生從美國引進^[1-2]。野牛草耐旱性強，在年降水量300～600 mm的干旱、半干旱地區(qū)也可以正常生長，在持續(xù)干旱2～3個月的夏季生長狀況依舊良好。野牛草喜pH值為6.1～8.0的黏質土壤，但在高原丘陵瘠薄土壤上也可頑強生長；野牛草具有較強的耐寒性，在我國北方大部分地區(qū)都可越冬，甚至在西北、東北的寒冷地帶-39°C的低溫條件下也可以正常越冬^[3-6]。由于野牛草良好的抗逆性，應用廣泛，對其研究也越來越多，但主要集中在品種選育^[7-9]和抗逆性[3，10-12]的研究方面，而對野牛草基因組DNA的研究相對較少。然而，對于我國這個水資源平均占有量不足世界平均水平1/4，被聯(lián)合國列入世界13個貧水國之一的國家來說^[13]，收集優(yōu)質草坪種質材料，對其生物學特征及遺傳多樣性進行分析鑒定研究，篩選具有觀賞價值和節(jié)水環(huán)保作用的草坪品種，有著廣泛的應用前景和現(xiàn)實意義的。關于植物基因組DNA提取方法，國內外都有一定的研究，包括高粱等作物^[14]、紅掌等花卉^[15]以及狗牙根等草坪草^[16-17]。本試驗結合國內外相關研究，參考Staub等的研究方法^[18-20]，針對野牛草的特性，如葉片纖維含量高，具有絨毛、韌性高的特點，對適合基因組DNA提取的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、十二烷基磺酸鈉（SDS）法、高鹽法3種方法進行比較，篩選出最佳方法。旨在為野牛草未來的遺傳多樣性研究提供一定的參考，同時也為適應我國城市綠化以及西部生態(tài)環(huán)境建設的需要，培育適合我國國情的環(huán)保型耐旱草坪植物奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為中國農業(yè)科學院畜牧研究所培育的野牛草品系植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 野牛草基因組DNA的提取方法

CTAB法：（1）取野牛草葉片3～5 g，用蒸餾水洗凈，吸干表面水珠后置于 1.5 mL 離心管中，加入適量液氮致冷，研成細粉；（2）吸取 900 μL 提前預熱到65 ℃的CTAB提取液加入到樣品中混勻；（3）將離心管放入水浴槽中，在65 ℃的溫度下浸提15～20 min，每 2 min 取出充分混勻；（4）取出冷卻后，加入500 μL三氯甲烷-異戊醇（24 ∶1），振蕩5 min；（5）在6 000～8 000 r/min 下離心10 min；（6）棄上清液，重復4～5步；（7）取出上清液后，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻至出現(xiàn)白色絮狀沉淀；（8）在12 000 r/min下離心5 min，棄上清液；（9）用75%乙醇清洗2次，在室溫干燥1 h后溶入200 μL的TE緩沖液（2 mol/L Tris-HCl；0.5 mol/L EDTA），在4 ℃的溫度條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS法：（1）取葉片0.05～0.1 g，置于1.5 mL離心管中，適量液氮冷凍后研磨成粉；（2）加入400 μL預熱至 65 ℃ 的緩沖液（100 mmol/L Tris-Cl，pH值8.0；50 mmol/L EDTA；500 mmol/L NaCl；15 mg/mL SDS；10 mmol/L 2-巰基乙醇；30 mg/mL PVP）；（3）混勻后置于65 ℃的水浴中0.5～1 h；（4）冷卻后，加入1/3體積的5 mol/L KAC，置于冰箱 10 min，取出后再加入1/3體積的三氯甲烷/異戊醇，混勻后離心 10 min；（5）將上清移至另1支加入了等體積預冷異丙醇的離心管中，輕輕混勻，在13 000 r/min下離心10 min；（6）棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，在室溫下干燥；（7）加入 50 μL TE 溶解沉淀，經(jīng)RNase酶消化后保存?zhèn)溆谩?/p>

高鹽法：（1）取0.05～0.1 g 葉片，加入液氮研成粉末后分裝于1.5 mL的離心管中；（2）加入400 μL DNA 高鹽提取緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl，pH值8.0；2 mmol/L NaCl；70 mmol/L EDTA，pH值8.0），加入100 μL 5%肌氨酸鈉，混勻；（3）放入65 ℃水浴鍋中保溫30 min，其間翻轉離心管2～3次；（4）冷卻后在13 000 r/min 離心15 min，取上清液至新離心管中，加入RNase酶37 ℃保溫30～60 min；（5）然后加入等體積三氯甲烷/異戊醇（24 ∶1），混勻，13 000 r/min下離心 10 min；（6）取上清液至新的離心管中，加入0.2倍體積的 10 mol/L NH4Ac和0.7倍體積的異丙醇，混勻，放入-20 ℃冰箱中靜置30 min；（7）在13 000 r/min下離心15 min，棄上清，倒置離心管1 min；（8）加入70%乙醇500 μL洗滌，在 13 000 r/min 下離心2～3 min，棄上清液，重復洗凈2次，于室溫下晾干；（9）加入30～50 μL TE，65 ℃水浴中溶解 30 min，放入-20 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?

1.2.2 基因組DNA純度檢測

制備0.8%瓊脂糖凝膠，取DNA 2 μL，在1×TAE緩沖液、電場強度3～5 V/cm條件下電泳60～90 min。放入紫外燈下觀察、拍照，觀察點樣孔及整個泳道，判斷DNA樣品純度。

1.2.3 基因組DNA總濃度測定

將4 μL DNA樣品和 396 μL TE混勻后，放入分光光度計中測量并記錄DNA樣品D260 nm/D280 nm值以及DNA濃度，若D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之間時，說明DNA樣品純度好，適于作RAPD分析。同時根據(jù)D260 nm值為1的DNA樣品濃度為50 ng/μL計算DNA濃度，計算公式為：

2 結果與分析

2.1 DNA電泳檢測結果

采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳對用CTAB等3種方法提取的DNA分別進行純度檢測，結果（圖1）表明，3種方法所提取到的DNA譜帶亮度差異不明顯，觀察DNA泳道，背景都比較清晰，說明DNA的完整性較好，蛋白質、RNA及其他雜質均比較少，可以滿足RAPD試驗的要求。檢測結果表明3種方法都可用于野牛草基因組DNA的提取。

2.2 DNA總濃度測定結果

試驗用3種不同提取方法均得到了野牛草葉片的基因組DNA，但在純度和產率上有一定的差別。如表1所示，SDS法產率最高，達到310～375 ng/mg之間，但其質量最差，D260 nm/D280 nm 值為1.25～1.60，若想達到試驗要求還須繼續(xù)純化；CTAB法所提DNA質量最好，D260 nm/D280 nm比值為 1.76～1.94，且產率較高，達到240～360 ng/mg；高鹽法所提DNA質量和產率均處于CTAB法和SDS法之間，D260 nm/D280 nm 值為1.57～1.82，產率為230～360 ng/mg。綜合來看，3種方法提取到的野牛草葉片DNA的純度、完整性都較好，但CTAB法提取的D260 nm/D280 nm比值最高，所以CTAB法是提取野牛草基因組DNA的最佳方法。

3 結論與討論

獲得一定數(shù)量和質量的DNA樣品，是進行PCR等分子生物學試驗的前提。目前，根據(jù)研究目的和研究對象的差異，國內外研究者往往都采取不同的DNA提取方法^[21-27]。其中有使用較通用方法的，也有針對某一具體物種或針對含多糖、多酚等次生代謝物植物而使用改良方法的。而如果所提取的DNA樣品用于PCR分析，則DNA提取的步驟越少越好，否則多步驟多試劑容易造成交叉污染，而PCR極其靈敏，步驟繁多容易影響PCR的準確性^[26]。

本試驗針對野牛草葉片纖維含量較高，具有絨毛、韌性高等特點，設計采用CTAB法、SDS法以及高鹽法分別提取到了野牛草基因組DNA，并對3種方法進行比較，對所得DNA的濃度和純度進行了檢測。結果表明，3種不同的方法均可提取野牛草葉片的基因組DNA，但在純度和產率上卻有著明顯的差別。SDS法產率最高，但質量最差，D260 nm/D280 nm值為1.25～1.60，需要繼續(xù)純化才能用于RAPD反應；CTAB法所提取到的DNA質量最好，顏色為白色，D260 nm/D280 nm值為 1.76～1.93，且產率較高，可達240～355 ng/mg；高鹽法所提取得到的DNA質量和產率均介于其他2種方法之間。

所述，CTAB法、SDS法以及高鹽法提取的野牛草葉片基因組DNA的純度和完整性都較好，其中以CTAB法提取的DNA D值最高。因此，提取野牛草基因組DNA的最佳方法是CTAB法。

但是，在利用CTAB法提取野牛草基因組DNA時，需要注意以下幾點問題：（1）野牛草葉片的纖維含量較高，且具有絨毛、韌性高等特點，短時間的研磨不能完全破壞野牛草葉片細胞的細胞壁，所以在提取過程用液氮研磨時一定要充分；（2）CTAB緩沖液一定要現(xiàn)配現(xiàn)用，并且為了使其更好地發(fā)揮裂解作用，一定要預熱，并在緩沖液中加入2% PVP；（3）在研磨前加入2% β-巰基乙醇。如果在溫度過高的季節(jié)提取，要盡量使用超低溫離心機；（4）機械張力極其容易造成DNA分子的斷裂，所以在抽提過程中，要小心操作；此外，為獲得較高濃度的DNA，可以在吸取上清液減少的前提下，盡量減少抽提次數(shù)。

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