仁青常覺治療卵巢癌的作用研究

吳洪革　馬宏偉　付素心

【摘要】 目的：觀察藏藥仁青常覺治療卵巢癌的作用。方法：通過對仁青常覺體及其含藥血清體外對卵巢癌細胞的抑制作用實驗研究，采用MTT法測定細胞存活率，比較各實驗組的細胞生長抑制狀況，觀察仁青常覺治療卵巢癌的作用。結(jié)果：仁青常覺可以抑制卵巢癌細胞的生長，效果與順鉑相當。結(jié)論：仁青常覺有治療卵巢癌的作用。

【關(guān)鍵詞】 仁青常覺； 卵巢癌； MTT法； 細胞生長抑制

仁青常覺系藏族驗方，成方于公元八世紀，最早是藏王、班禪、達賴以及達官貴人專用藥，歷經(jīng)一千多年的應用歷史，現(xiàn)如今，仁青常覺收載于《中國藥典》（2010版）一部中。仁青常覺由珍珠、朱砂、檀香、降香、沉香、訶子、牛黃、人工廖香、西紅花等一百余味藥組成，功能為清熱解毒、調(diào)和滋補。用于“隆、赤巴、培根”各病，陳舊性胃腸炎、潰瘍，“木布”病，萎縮性胃炎，各種中毒癥；梅毒，麻風，陳舊熱病，炭疽，癤痛，干黃水，化膿等[1-2]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)仁青常覺仁青常覺有治療卵巢癌的作用。本文采用MTT法測定細胞存活率，比較各實驗組的細胞生長抑制狀況，觀察仁青常覺治療卵巢癌的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康昆明種小鼠50只，體重（30±2）g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司新實驗動物提供，動物合格證號：SCXK魯201300010。

1.2 主要試劑和藥品 卵巢癌（skov3）細胞：山東省立醫(yī)院；仁青常覺：金訶藏藥股份有限公司；順鉑，批號：1010041DC；試劑：1640細胞培養(yǎng)基：賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司；胎牛血清：賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司；胰酶細胞消化液（碧云天），青霉素鏈霉素混合液雙抗，注射用順鉑：齊魯制藥有限公司，批號：1010041DC。

1.3 實驗儀器 立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50FBS，上海申安；雙人單面凈化工作臺：SW-CJ-1C，蘇州凈化；二氧化碳培養(yǎng)箱；臺式離心機；酶標儀：MK3，賽默飛世爾生物化學制品北京有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：101，上海鵬順科學儀器有限公司；倒置顯微鏡：XDS-1B，重慶光學儀器廠；水浴恒溫振蕩器：SHZ-82，金壇市醫(yī)療儀器廠；移液器；培養(yǎng)瓶；96孔板。

1.4 實驗方法

1.4.1 仁青常覺體外對卵巢癌細胞的抑制作用實驗

1.4.1.1 細胞復蘇和培養(yǎng) 從超低溫冰箱中取凍存的卵巢癌（skov3）細胞，迅速投入預先加熱到37 ℃的滅菌水中，待凍存液溶化后，2000 r/min離心3 min，收集細胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鮮培養(yǎng)基在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[3-5]。

1.4.1.2 接種 待細胞生長至80%融合時，以0.25%的胰酶細胞消化液（含0. 02%EDTA）進行消化，以1×104個細胞每孔接種于96孔板中，預留3個調(diào)零孔，調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細胞。

1.4.1.3 加藥 待96孔板中的細胞長滿單層后，棄掉培養(yǎng)基，調(diào)零組、空白對照組加100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基，陽性對照組加10 μg/mL順鉑100 μL。其他給藥組每孔分別加入含梯度稀釋濃度的篩選藥物的1640培養(yǎng)基100 μL，加藥一排。然后細胞在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，所加仁青常覺低、中、高劑量組給藥濃度分別為5、10、20 mg /mL。

1.4.1.4 測定 MTT法測定細胞存活率。在每孔加入 5 mg/mL MTT溶液20 μL于培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應4 h。然后加入100 u L DMSO用酶標儀于492 nm測定OD值，計算抑制率。細胞生長抑制率=（對照組OD平均值-實驗組OD平均值）/對照組OD平均值×100%。

1.4.2 仁青常覺含藥血清體外對卵巢癌細胞的抑制作用實驗

1.4.2.1 細胞復蘇和培養(yǎng) 從超低溫冰箱中取凍存的卵巢癌（skov3）細胞，迅速投入預先加熱到37 ℃的滅菌水中，待凍存液溶化后，2000 r/min離心3 min，收集細胞。然后以含10%胎牛血清的1640新鮮培養(yǎng)基在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2.2 含藥血清的制備 昆明種小鼠50只，隨機分為五組，空白對照組、順鉑組、仁青常覺低、中、高劑量組，每組10只。順鉑組給藥濃度為10 μg/mL。仁青常覺低、中、高劑量組給藥濃度分別為5、10、20 mg/mL，各組小鼠連續(xù)灌胃3 d，每天每只0.5 mL，相當于人體最大建議劑量的100倍。其中空白對照組給予生理鹽水。最后一天灌胃后1 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3000 r/min離心，取上層血清，-80 ℃保存。同組血清混合，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌于備用。

1.4.2.3 MTT法測定含藥血清對不同腫瘤細胞生長的抑制狀況 將CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的卵巢癌（skov3）細胞，以0.25%的胰酶細胞消化液（含0.02%EDTA）進行消化，以1×104個細胞每孔接種于96孔板中，預留3個調(diào)零孔，調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加細胞。待96孔板中的細胞長滿單層后，棄掉培養(yǎng)基，調(diào)零組、空白對照組加100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基，其余每孔分別加入含藥血清的1640培養(yǎng)基100μL，每個濃度的藥物加6孔。然后細胞在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入5 mg/mL MTT溶液20 μL于培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應4 h[6-7]。然后加入100 μL DMSO用酶標儀于492 nm測定OD值，計算抑制率。細胞生長抑制率=（對照組吸光度平均值-實驗組吸光度平均值）/對照組吸光度平均值×100%。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 仁青常覺體外對卵巢癌細胞的抑制作用 仁青常覺低劑量組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，順鉑、仁青常覺中、高劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），仁青常覺中、高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且仁青常覺高劑量組抑制率高于中劑量組。說明仁青常覺對卵巢癌細胞有較好的抑制作用，且呈濃度依賴性。其效果與順鉑相當或略優(yōu)。見表1。

表1 仁青常覺對卵巢癌細胞的抑制率（x±s）

組別 濃度（mg/mL） 抑制率（%）

空白對照組（n=10） 0 -

順鉑組（n=10） 0.01 28.70±12.45*

仁青常覺低劑量組（n=10） 5 20.40±13.08

仁青常覺中劑量組（n=10） 10 33.20±9.71*

仁青常覺高劑量組（n=10） 20 35.60±10.23*

*與空白對照組比較，P<0.05

2.2 仁青常覺含藥血清體外對卵巢癌細胞的抑制作用 仁青常覺低劑量組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，順鉑、仁青常覺中、高劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），仁青常覺中、高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且仁青常覺高劑量組抑制率高于中劑量組。說明仁青常覺的含藥血清對卵巢癌均具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性。其中仁青常覺中高濃度效果略優(yōu)于順鉑。見表2。

表2 仁青常覺含藥血清對卵巢癌的抑制率（x±s）

組別 濃度（mg/mL） 抑制率（%）

空白對照組（n=10） 0 -

順鉑組（n=10） 0.01 32.70±10.35*

仁青常覺低劑量組（n=10） 5 22.60±12.51

仁青常覺中劑量組（n=10） 10 38.20±14.08*

仁青常覺高劑量組（n=10） 20 40.20±11.84*

*與空白對照組比較，P<0.05

3 討論

卵巢癌發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位，且呈逐年上升的趨勢，美國2009年統(tǒng)計，21 550例新發(fā)卵巢癌患者中14 600人死亡，是婦科死亡率最高的惡性腫瘤之一，對婦女生命造成嚴重威脅[8-13]。目前卵巢癌的臨床治療主要采用手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療，但化療在抑制和殺滅腫瘤細胞的同時，會損傷人體的正常細胞，降低機體的免疫力，嚴重損害身體健康，且絕大多數(shù)晚期患者會在5年內(nèi)復發(fā)，或發(fā)展為化療耐藥，其5年生存率<50%，這已成為困擾婦產(chǎn)科醫(yī)師的一大難題[14-17]。腫瘤的發(fā)生與多種癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)，在多種基因作用下，細胞異常增殖和凋亡抑制是其發(fā)生的重要機制。近年來，中藥治療腫瘤特別是對誘導細胞凋亡的研究受到學者們的廣泛關(guān)注，中藥不僅對腫瘤具有抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，而且對機體的損傷和副作用也較小，因而研究中藥抗腫瘤作用及其單體的篩選是我國科學工作者的重要課題之一，尋找出能誘導腫瘤細胞凋亡、副作用小、療效好的中藥已成為當前腫瘤治療的熱點和方向[18]。

順鉑（DDP）一直被認為是最理想的腔內(nèi)治療的藥物。單用DDP全身化療有效者中，56%腹腔化療有效，但順鉑對腎臟、耳、神經(jīng)有明顯不良作用[19]。仁青常覺為經(jīng)典藏藥，現(xiàn)代藥效學研究結(jié)果表明，本品具有抗炎、抑制潰瘍形成、促進潰瘍愈合等作用。急性毒性試驗，長期毒性試驗結(jié)果表明，本品無明顯毒性。并且有良好的保健作用，是藏醫(yī)保健藥品之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)仁青常覺可以抑制卵巢癌細胞的生長，效果與順鉑相當或略優(yōu)，具有很好的治療卵巢癌的作用。作為保健藥品，其副作用較小，極大地彌補了現(xiàn)存治療卵巢癌藥物副作用巨大的不足，為卵巢癌患者帶來福音。本研究證實了仁青常覺對卵巢癌的作用是通過抑制癌細胞的生長作用來實現(xiàn)，為其發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機制，為臨床上選用有效的抗腫瘤藥物提供了較充分的理論依據(jù)。而仁青常覺的抑制細胞生長所調(diào)控的基因及其他方面的作用機制有待進一步研究。

參考文獻

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[17] 梁華茂，江森. 卵巢癌順鉑耐藥的分子機制研究進展[J]. 國外醫(yī)學：婦產(chǎn)科學分冊，2001，28（4）：220-222.

[18] 楊旭東，張杰，王桂云，等. 威靈仙多糖對人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響[J]. 中醫(yī)藥通報，2011，10（2）：61-62.

[19] 柏朝益，唐小麗，李勝平. 晚期卵巢癌藥物治療的研究進展[J]. 成都軍區(qū)醫(yī)院學報，2002，4（4）：32-34.

（收稿日期：2014-02-26） （本文編輯：陳丹云）endprint

2 結(jié)果

2.1 仁青常覺體外對卵巢癌細胞的抑制作用 仁青常覺低劑量組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，順鉑、仁青常覺中、高劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），仁青常覺中、高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且仁青常覺高劑量組抑制率高于中劑量組。說明仁青常覺對卵巢癌細胞有較好的抑制作用，且呈濃度依賴性。其效果與順鉑相當或略優(yōu)。見表1。

表1 仁青常覺對卵巢癌細胞的抑制率（x±s）

組別 濃度（mg/mL） 抑制率（%）

空白對照組（n=10） 0 -

順鉑組（n=10） 0.01 28.70±12.45*

仁青常覺低劑量組（n=10） 5 20.40±13.08

仁青常覺中劑量組（n=10） 10 33.20±9.71*

仁青常覺高劑量組（n=10） 20 35.60±10.23*

*與空白對照組比較，P<0.05

2.2 仁青常覺含藥血清體外對卵巢癌細胞的抑制作用 仁青常覺低劑量組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，順鉑、仁青常覺中、高劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），仁青常覺中、高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且仁青常覺高劑量組抑制率高于中劑量組。說明仁青常覺的含藥血清對卵巢癌均具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性。其中仁青常覺中高濃度效果略優(yōu)于順鉑。見表2。

表2 仁青常覺含藥血清對卵巢癌的抑制率（x±s）

組別 濃度（mg/mL） 抑制率（%）

空白對照組（n=10） 0 -

順鉑組（n=10） 0.01 32.70±10.35*

仁青常覺低劑量組（n=10） 5 22.60±12.51

仁青常覺中劑量組（n=10） 10 38.20±14.08*

仁青常覺高劑量組（n=10） 20 40.20±11.84*

*與空白對照組比較，P<0.05

3 討論

卵巢癌發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位，且呈逐年上升的趨勢，美國2009年統(tǒng)計，21 550例新發(fā)卵巢癌患者中14 600人死亡，是婦科死亡率最高的惡性腫瘤之一，對婦女生命造成嚴重威脅[8-13]。目前卵巢癌的臨床治療主要采用手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療，但化療在抑制和殺滅腫瘤細胞的同時，會損傷人體的正常細胞，降低機體的免疫力，嚴重損害身體健康，且絕大多數(shù)晚期患者會在5年內(nèi)復發(fā)，或發(fā)展為化療耐藥，其5年生存率<50%，這已成為困擾婦產(chǎn)科醫(yī)師的一大難題[14-17]。腫瘤的發(fā)生與多種癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)，在多種基因作用下，細胞異常增殖和凋亡抑制是其發(fā)生的重要機制。近年來，中藥治療腫瘤特別是對誘導細胞凋亡的研究受到學者們的廣泛關(guān)注，中藥不僅對腫瘤具有抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，而且對機體的損傷和副作用也較小，因而研究中藥抗腫瘤作用及其單體的篩選是我國科學工作者的重要課題之一，尋找出能誘導腫瘤細胞凋亡、副作用小、療效好的中藥已成為當前腫瘤治療的熱點和方向[18]。

順鉑（DDP）一直被認為是最理想的腔內(nèi)治療的藥物。單用DDP全身化療有效者中，56%腹腔化療有效，但順鉑對腎臟、耳、神經(jīng)有明顯不良作用[19]。仁青常覺為經(jīng)典藏藥，現(xiàn)代藥效學研究結(jié)果表明，本品具有抗炎、抑制潰瘍形成、促進潰瘍愈合等作用。急性毒性試驗，長期毒性試驗結(jié)果表明，本品無明顯毒性。并且有良好的保健作用，是藏醫(yī)保健藥品之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)仁青常覺可以抑制卵巢癌細胞的生長，效果與順鉑相當或略優(yōu)，具有很好的治療卵巢癌的作用。作為保健藥品，其副作用較小，極大地彌補了現(xiàn)存治療卵巢癌藥物副作用巨大的不足，為卵巢癌患者帶來福音。本研究證實了仁青常覺對卵巢癌的作用是通過抑制癌細胞的生長作用來實現(xiàn)，為其發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機制，為臨床上選用有效的抗腫瘤藥物提供了較充分的理論依據(jù)。而仁青常覺的抑制細胞生長所調(diào)控的基因及其他方面的作用機制有待進一步研究。

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[14] 莊瑩瑩，王海琳，杜瑞亭，等. 丹參酮IIA誘導人卵巢癌SKOV3細胞凋亡及機制的研究[J]. 國際婦產(chǎn)科學雜志，2011，38（4）：328-332.

[15] 劉或，李懷芳. 卵巢癌化療耐藥機制的研究進展[J]. 同濟大學學報（醫(yī)學版），2006，27（12）：28-30.

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[18] 楊旭東，張杰，王桂云，等. 威靈仙多糖對人卵巢癌SKOV3細胞凋亡的影響[J]. 中醫(yī)藥通報，2011，10（2）：61-62.

[19] 柏朝益，唐小麗，李勝平. 晚期卵巢癌藥物治療的研究進展[J]. 成都軍區(qū)醫(yī)院學報，2002，4（4）：32-34.

（收稿日期：2014-02-26） （本文編輯：陳丹云）endprint

2 結(jié)果

2.1 仁青常覺體外對卵巢癌細胞的抑制作用 仁青常覺低劑量組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，順鉑、仁青常覺中、高劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），仁青常覺中、高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且仁青常覺高劑量組抑制率高于中劑量組。說明仁青常覺對卵巢癌細胞有較好的抑制作用，且呈濃度依賴性。其效果與順鉑相當或略優(yōu)。見表1。

表1 仁青常覺對卵巢癌細胞的抑制率（x±s）

組別 濃度（mg/mL） 抑制率（%）

空白對照組（n=10） 0 -

順鉑組（n=10） 0.01 28.70±12.45*

仁青常覺低劑量組（n=10） 5 20.40±13.08

仁青常覺中劑量組（n=10） 10 33.20±9.71*

仁青常覺高劑量組（n=10） 20 35.60±10.23*

*與空白對照組比較，P<0.05

2.2 仁青常覺含藥血清體外對卵巢癌細胞的抑制作用 仁青常覺低劑量組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，順鉑、仁青常覺中、高劑量組與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），仁青常覺中、高劑量組與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），且仁青常覺高劑量組抑制率高于中劑量組。說明仁青常覺的含藥血清對卵巢癌均具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性。其中仁青常覺中高濃度效果略優(yōu)于順鉑。見表2。

表2 仁青常覺含藥血清對卵巢癌的抑制率（x±s）

組別 濃度（mg/mL） 抑制率（%）

空白對照組（n=10） 0 -

順鉑組（n=10） 0.01 32.70±10.35*

仁青常覺低劑量組（n=10） 5 22.60±12.51

仁青常覺中劑量組（n=10） 10 38.20±14.08*

仁青常覺高劑量組（n=10） 20 40.20±11.84*

*與空白對照組比較，P<0.05

3 討論

卵巢癌發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第3位，且呈逐年上升的趨勢，美國2009年統(tǒng)計，21 550例新發(fā)卵巢癌患者中14 600人死亡，是婦科死亡率最高的惡性腫瘤之一，對婦女生命造成嚴重威脅[8-13]。目前卵巢癌的臨床治療主要采用手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療，但化療在抑制和殺滅腫瘤細胞的同時，會損傷人體的正常細胞，降低機體的免疫力，嚴重損害身體健康，且絕大多數(shù)晚期患者會在5年內(nèi)復發(fā)，或發(fā)展為化療耐藥，其5年生存率<50%，這已成為困擾婦產(chǎn)科醫(yī)師的一大難題[14-17]。腫瘤的發(fā)生與多種癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)，在多種基因作用下，細胞異常增殖和凋亡抑制是其發(fā)生的重要機制。近年來，中藥治療腫瘤特別是對誘導細胞凋亡的研究受到學者們的廣泛關(guān)注，中藥不僅對腫瘤具有抑制作用，不易產(chǎn)生耐藥性，而且對機體的損傷和副作用也較小，因而研究中藥抗腫瘤作用及其單體的篩選是我國科學工作者的重要課題之一，尋找出能誘導腫瘤細胞凋亡、副作用小、療效好的中藥已成為當前腫瘤治療的熱點和方向[18]。

順鉑（DDP）一直被認為是最理想的腔內(nèi)治療的藥物。單用DDP全身化療有效者中，56%腹腔化療有效，但順鉑對腎臟、耳、神經(jīng)有明顯不良作用[19]。仁青常覺為經(jīng)典藏藥，現(xiàn)代藥效學研究結(jié)果表明，本品具有抗炎、抑制潰瘍形成、促進潰瘍愈合等作用。急性毒性試驗，長期毒性試驗結(jié)果表明，本品無明顯毒性。并且有良好的保健作用，是藏醫(yī)保健藥品之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)仁青常覺可以抑制卵巢癌細胞的生長，效果與順鉑相當或略優(yōu)，具有很好的治療卵巢癌的作用。作為保健藥品，其副作用較小，極大地彌補了現(xiàn)存治療卵巢癌藥物副作用巨大的不足，為卵巢癌患者帶來福音。本研究證實了仁青常覺對卵巢癌的作用是通過抑制癌細胞的生長作用來實現(xiàn)，為其發(fā)揮抗腫瘤作用的可能機制，為臨床上選用有效的抗腫瘤藥物提供了較充分的理論依據(jù)。而仁青常覺的抑制細胞生長所調(diào)控的基因及其他方面的作用機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2014-02-26） （本文編輯：陳丹云）endprint