透明質(zhì)酸生產(chǎn)中生物發(fā)酵工藝過(guò)程

姜暉

（恩宜琺瑪（天津）工程有限公司上海分公司，上海 200052）

透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝是典型的生物發(fā)酵及提取過(guò)程。其中，生物發(fā)酵復(fù)雜多變，并且直接影響到產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程至關(guān)重要，本文將對(duì)其著重介紹。

1 透明質(zhì)酸

透明質(zhì)酸（bHA）具有良好的保濕作用，其多用于制藥及化妝品，它的特點(diǎn)是保濕性受周圍環(huán)境的相對(duì)濕度影響較小。透明質(zhì)酸在相對(duì)濕度較低時(shí)(33%)吸濕量相對(duì)最高，在相對(duì)濕度較高時(shí)(75%)吸濕量相對(duì)最低。這種獨(dú)特的性質(zhì)適合不同季節(jié)、不同環(huán)境濕度(如干燥的冬季和潮濕的夏季)皮膚對(duì)化妝品保濕作用的要求。

透明質(zhì)酸分子中含有大量的羧基和羥基，在水；溶液中形成分子內(nèi)和分子間的氫鍵，這使其具有強(qiáng)大的保水作用，可結(jié)合自身400倍以上的水；在較高濃度時(shí)，由于其分子間作用形成的復(fù)雜的三級(jí)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其水溶液又具有顯著的粘彈性。透明質(zhì)酸作為細(xì)胞間基質(zhì)的主要成分，直接參與細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)交流的調(diào)控，發(fā)揮物理和分子信息的過(guò)濾器作用。大分子透明質(zhì)酸對(duì)細(xì)胞移動(dòng)、增殖、分化及吞噬功能有抑制作用，小分子透明質(zhì)酸則有促進(jìn)作用。

透明質(zhì)酸可用作眼科人工晶體植入手術(shù)的粘彈劑、骨性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)手術(shù)的填充劑，作為媒介在滴眼液中廣泛應(yīng)用，還用于預(yù)防術(shù)后粘連和促進(jìn)皮膚傷口的愈合。與其它藥物反應(yīng)形成的化合物對(duì)藥物發(fā)揮緩釋作用，可達(dá)到定向和定時(shí)釋放的目的。隨著醫(yī)藥科技的發(fā)展，透明質(zhì)酸在醫(yī)藥方面的應(yīng)用將越來(lái)越廣泛。

2 透明質(zhì)酸生產(chǎn)中的生物發(fā)酵

透明質(zhì)酸生產(chǎn)中生物發(fā)酵簡(jiǎn)單的工藝流程見圖1:

圖1

2.1 混料

混料罐用于進(jìn)行原材料的預(yù)混，預(yù)混好的料將用于種子發(fā)酵工序或者主發(fā)酵工序。混料罐是手動(dòng)操作，原材料和溶液在混料罐中通過(guò)攪拌混勻以后通過(guò)泵轉(zhuǎn)移至下一級(jí)罐，而混料罐的在線清洗是通過(guò)在線清洗站自動(dòng)控制來(lái)完成?；炝瞎薜娜莘e大小需根據(jù)產(chǎn)品產(chǎn)量來(lái)決定，混料的時(shí)間通常小于1h。

具體操作流程為：

1）將料斗安裝在罐口，另一端接到排風(fēng)系統(tǒng)以防止粉塵散落到房間中。2）打開手動(dòng)操作閥門通過(guò)觀察稱重傳感器加入一定量的純水在混料罐中。3）將裝有原材料的袋子通過(guò)叫料斗倒入混料罐。4）pH值按工藝需要調(diào)節(jié)到4～10。5）當(dāng)原材料完全被倒入罐底以后，將攪拌器調(diào)整至高速。6）通過(guò)傳輸泵將混合好后的溶液轉(zhuǎn)移至種子發(fā)酵罐。7）混料罐溶液轉(zhuǎn)移完成以后需要通過(guò)在線清洗站做在線清洗，此時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)速需要跳到低速，在線清洗可以將罐中殘留清洗干凈，以免對(duì)下一個(gè)批次產(chǎn)生污染及影響。

2.2 給料

給料罐用于準(zhǔn)備蔗糖溶液，而后蔗糖溶液被轉(zhuǎn)移至種子發(fā)酵罐或者主發(fā)酵罐。通常給料罐包含兩個(gè)給料罐和一條轉(zhuǎn)移管道，目的是為了操作可以在循環(huán)模式下進(jìn)行，以確保每一個(gè)罐都能通過(guò)一個(gè)循環(huán)。當(dāng)一個(gè)罐里的蔗糖溶液用完以后，將會(huì)從轉(zhuǎn)移管道斷開，進(jìn)行清洗、滅菌，再加入新的培養(yǎng)基溶液再次連接到轉(zhuǎn)移管道，從而形成一個(gè)循環(huán)。所有的操作均為手動(dòng)操作，只有在線清洗為自動(dòng)操作。

具體操作流程為：

1）通過(guò)手動(dòng)閥門從轉(zhuǎn)移管道斷開給料罐，連接兩個(gè)給料罐通過(guò)特殊的截?cái)嚅y門，以保證不出現(xiàn)交叉污染。2）通過(guò)在線清洗站做在線清洗，此時(shí)攪拌器轉(zhuǎn)速需要跳到低速。在線清洗是為了確保罐里沒有上一批次溶液的殘留和污染。3）培養(yǎng)基準(zhǔn)備：安裝手動(dòng)料斗在罐口，另一端接到排風(fēng)系統(tǒng)以防止粉塵散落到房間中。4）打開手動(dòng)操作閥門通過(guò)觀察稱重傳感器加入一定量的純水在給料罐中。5）將裝有蔗糖的袋子通過(guò)叫料斗全部倒入給料罐中。6）給料罐通過(guò)蒸氣進(jìn)行加熱。7）當(dāng)蔗糖完全被傾倒入罐底以后，攪拌器需要調(diào)整至高速。8）關(guān)閉罐口，使給料罐可以進(jìn)行滅菌。9）給料罐自動(dòng)被潔凈蒸汽加熱到95℃，為了降低振動(dòng)需要在潔凈蒸汽中混入一些空氣。10）繼續(xù)再加熱到滅菌溫度。11）保持在滅菌溫度下設(shè)定的滅菌時(shí)間。12）滅菌完成后由操作人員打開冷卻水，進(jìn)行冷卻。13）冷卻到需求溫度后轉(zhuǎn)移至下一級(jí)發(fā)酵罐。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)箱用于最初的細(xì)胞培養(yǎng)，是一個(gè)單獨(dú)的設(shè)備。細(xì)胞在錐形瓶中的培養(yǎng)基里面增長(zhǎng)并且在恒溫恒濕的環(huán)境下，培養(yǎng)箱通過(guò)控制溫度達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)的最佳環(huán)境。因此培養(yǎng)箱內(nèi)部溫度的恒定性驗(yàn)證需要通過(guò)驗(yàn)證儀來(lái)校驗(yàn)合格。

2.4 種子發(fā)酵

種子發(fā)酵罐用于生物轉(zhuǎn)換糖和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入到產(chǎn)品中而進(jìn)行生物發(fā)酵。營(yíng)養(yǎng)液在種子發(fā)酵罐中進(jìn)行滅菌，然后加入預(yù)滅菌的蔗糖溶液，在發(fā)酵罐被潔凈蒸汽冷凝水充滿之前，接種物質(zhì)開始接種到種子發(fā)酵罐當(dāng)中。種子發(fā)酵完成后形成的種子液體培養(yǎng)基將會(huì)轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的主發(fā)酵罐中進(jìn)行進(jìn)一步的發(fā)酵。

具體操作流程為：

1）培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移。2）稱量電極已校驗(yàn)，閥門已連接好。3）將混料罐和主發(fā)酵罐通過(guò)軟管連接好，將混料罐中的溶液轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐當(dāng)中達(dá)到規(guī)定的液位值。4）攪拌器調(diào)至一定轉(zhuǎn)速。5）確保儲(chǔ)罐，閥門達(dá)到可以滅菌狀態(tài)包括冷卻夾套和盤管的放凈。6）滅菌：過(guò)程分為三個(gè)階段：加熱排除空氣；加熱到95℃排除空氣；繼續(xù)加熱到121～125℃，保持滅菌一定時(shí)間。整個(gè)過(guò)程通過(guò)PLC來(lái)控制。7）冷卻：關(guān)閉蒸汽開啟潔凈空氣避免發(fā)酵罐壓力過(guò)大。8）壓力保持一定冷卻到控制的發(fā)酵溫度。9）消毒后pH值調(diào)整：消毒后通過(guò)加入磷酸來(lái)調(diào)整pH值4～9。10）接種之前加入維生素和NaOH。11）從給料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接種：將接種物質(zhì)從罐口加入。13）發(fā)酵：保持合適的溫度20～45℃，攪拌速度，壓力0～1bar和空氣流量。14）接種轉(zhuǎn)移：通過(guò)輸送管道轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐。15）在線清洗：接種液傳輸完畢，進(jìn)行在線清洗，以防止交叉污染。

2.5 主發(fā)酵過(guò)程

主發(fā)酵過(guò)程與種子發(fā)酵過(guò)程相似。主發(fā)酵罐用于生物轉(zhuǎn)換糖和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入到產(chǎn)品中進(jìn)行生物發(fā)酵。營(yíng)養(yǎng)液在主發(fā)酵罐中進(jìn)行滅菌，然后加入預(yù)滅菌的蔗糖溶液，在發(fā)酵罐被潔凈蒸汽冷凝水充滿之前，接種物質(zhì)開始接種到主發(fā)酵罐當(dāng)中。主發(fā)酵完成后形成的溶液轉(zhuǎn)移至下一步提取過(guò)程中。

具體操作流程為：

1）培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移。2）稱量電極已校驗(yàn)，閥門已連接好。3）將混料罐和主發(fā)酵罐通過(guò)軟管連接好，將混料罐中的溶液轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐當(dāng)中達(dá)到規(guī)定的液位值。4）攪拌器調(diào)至一定轉(zhuǎn)速。5）確保儲(chǔ)罐，閥門達(dá)到可以滅菌狀態(tài)包括冷卻夾套和盤管的放凈。6）滅菌，過(guò)程分為三個(gè)階段：加熱排除空氣；加熱到95℃排除空氣；繼續(xù)加熱到121～125℃，保持滅菌一定時(shí)間。整個(gè)過(guò)程通過(guò)PLC來(lái)控制。7）冷卻：關(guān)閉蒸汽開啟潔凈空氣避免發(fā)酵罐壓力過(guò)大。8）壓力保持一定冷卻到控制的發(fā)酵溫度。9）消毒后pH值調(diào)整：消毒后通過(guò)加入磷酸來(lái)調(diào)整pH值4～9。10）接種之前加入維生素和NaOH。11）從給料罐中加入一定量的蔗糖溶液。12）接種：對(duì)種子罐到主發(fā)酵罐的傳輸管道滅菌。13）溶液從種子發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移至主發(fā)酵罐。14）發(fā)酵：pH值通過(guò)NH3或者H3PO4控制。15）蔗糖的加入通過(guò)溶解氧來(lái)控制適宜的流量。16）泡沫監(jiān)測(cè)器監(jiān)測(cè)到泡沫需要手動(dòng)加入止泡劑。17）保持合適的溫度20～45℃，攪拌速度，壓力0～1bar和空氣流量。18）收獲：收獲過(guò)程中主發(fā)酵罐通過(guò)潔凈空氣保持一定的壓力。19）將主發(fā)酵罐連接到下游提取相應(yīng)的設(shè)備。20）在線清洗：接種液傳輸完畢，進(jìn)行在線清洗，以防止交叉污染；在線清洗站自動(dòng)完成主發(fā)酵罐的在線清洗。

3 結(jié)語(yǔ)

經(jīng)過(guò)上述發(fā)酵過(guò)程，所得發(fā)酵液經(jīng)過(guò)過(guò)濾、提取、干燥即可得到透明質(zhì)酸粉末狀成品。整個(gè)工藝過(guò)程穩(wěn)定可控，可根據(jù)具體產(chǎn)量要求放大或縮小生產(chǎn)規(guī)模。