治療性亞低溫對缺血再灌注損傷神經(jīng)功能保護作用機制的研究進展

李恒 黃子通

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.09.030

作者單位：523900 廣東省東莞，東莞市太平人民醫(yī)院急診科（李恒）；中山大學心肺腦復蘇研究所（黃子通）

通信作者：李恒，Email：lh12818@163.com

治療性亞低溫（32～34 ℃）被認為是目前對全腦缺血再灌注唯一有效的治療措施。按照循證醫(yī)學理論，美國心臟病協(xié)會、歐洲復蘇協(xié)會都將治療性亞低溫療法寫入心肺復蘇的國際指南中。在兼顧亞低溫實驗研究的基礎上，更強調(diào)臨床的轉(zhuǎn)化應用，以期挽救更多患者生命。目前，對亞低溫的基礎研究已經(jīng)進入到一個前所未有的發(fā)展水平，逐漸由最初的現(xiàn)象、早期的血流動力學、細胞形態(tài)學變化，深入到分子、基因等微觀水平。對亞低溫的長期效果，也逐漸開始重視，因此，本文就目前亞低溫對缺血后神經(jīng)功能保護機制的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1急性期效應（<24 h）

亞低溫的短期保護效應是目前研究成果最豐富的內(nèi)容，從血流動力學、能量代謝等方面都觀察到顯著的效果。

1.1 降低葡萄糖和氧代謝，保存高能磷酸化合物

Sakoh和Gjedde^[1]對正常麻醉狀態(tài)下家豬采取冰凍空氣降溫后發(fā)現(xiàn)，當腦溫降至32 ℃時，腦組織血流和氧消耗在第3～5小時內(nèi)會降至基礎狀態(tài)的50%，而氧攝取率則會增加140%。此外，Laptook等^[2]通過對心搏驟停后小豬腦組織內(nèi)31P和1H的核磁掃描后發(fā)現(xiàn)，腦溫度與組織能量代謝率呈正相關（r=0.92，P<0.01），并且溫度每下降1 ℃，能量代謝率會降低5.3%。在新生乳鼠缺血-缺氧性損傷的模型中也觀察到類似的結論，Williams等^[3]認為腦組織磷酸化潛能與ATP水平隨著溫度的降低可以保存，其中31 ℃下的腦水腫程度要比34 ℃、37 ℃顯著減輕。然而，動物實驗條件下的某些結論尚難推及臨床。例如，Gupta等^[4]對30例GCS<8分的腦損傷患者采取33 ℃亞低溫治療后發(fā)現(xiàn)，腦組織氧分壓（PO2）隨著溫度降低出現(xiàn)下降趨勢，并且在<35 ℃后下降更明顯，因此他認為腦溫低于35 ℃會影響腦組織的氧合程度。

1.2 改善腦組織血流灌注

亞低溫對腦組織血流的影響需要視情況而定。對于正常腦組織而言，其血流量會隨著溫度降低而下降，Palmer等^[5]通過表面低溫方法，對比新生狗重要器官（腦、心等）的血流量檢測后發(fā)現(xiàn)，基礎血流越豐富的器官，溫度降低后它們的血流下降得越明顯。在腦缺血損傷情況下，由于血管再灌注后病理生理條件存在，亞低溫的核心作用在于抑制再灌注后的血管自主調(diào)節(jié)功能障礙，即減少快速充血以及繼發(fā)的血流降低^[6]。此外，亞低溫的這種血管調(diào)節(jié)功能是低溫本身的直接效應，抑或是通過血管神經(jīng)-體液的間接調(diào)節(jié)機制，目前尚未有定論。

1.3 延遲缺氧去極化發(fā)生

神經(jīng)元缺氧去極化效應（anoxic depolarization，AD）是形態(tài)損傷出現(xiàn)之前的前兆性功能改變。Takeda等^[7]通過對沙鼠全腦缺血的模型發(fā)現(xiàn)，低溫能夠延遲AD的出現(xiàn)時間，而且溫度越低，AD出現(xiàn)時間越延遲。在此基礎上估算出，31 ℃亞低溫條件下，導致50%神經(jīng)元死亡的缺血時間為14.2 min，明顯長于常溫組。此外，Mori等^[8]對缺血后大鼠細胞外間隙、Na+、K+離子濃度分析后發(fā)現(xiàn)，31.5 ℃的低溫會延緩K+電位爆發(fā)、Na+電位衰減的時間，從而延緩了細胞外間隙縮小（腦水腫出現(xiàn)）的時間。這對臨床有重要的提示，即如果能夠在AD出現(xiàn)前進行亞低溫的干預，或許能避免或減輕后續(xù)神經(jīng)元細胞的永久損傷，最大限度的保存神經(jīng)功能。

1.4 減輕興奮毒性氨基酸損傷

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血損傷中最常見的興奮性氨基酸。實際上，細胞外的谷氨酸濃度（[Glu]e）反映的是其在神經(jīng)細胞中釋放和攝取之間動態(tài)平衡的結果。缺血缺氧發(fā)生后，谷氨酸在AD發(fā)生當時即開始從細胞內(nèi)釋放，隨著血管再灌注以及ATP的恢復，在AD得以改善的基礎上，谷氨酸也會被逐漸攝取至細胞內(nèi)部。研究發(fā)現(xiàn)，Glu的毒性作用主要是由于細胞外過多的谷氨酸激活了膜上的Ca2+通道，觸發(fā)Ca2+內(nèi)流引起相關損傷^[9]。通過全腦缺血動物模型，研究人員發(fā)現(xiàn)，亞低溫可以完全或部分抑制Glu釋放^[10-11]，延遲Glu釋放時間^[12-13]以及增加神經(jīng)細胞對Glu的攝取功能^[14-15]。Colbourne等^[16]進一步分析認為，亞低溫可以促進AMPA受體亞基——谷氨酸受體2（GluR2）mRNA早期恢復表達，而該受體的缺氧性下調(diào)被認為與Ca2+內(nèi)流增加有關。

1.5 調(diào)控細胞水平的應激反應

目前僅有為數(shù)不多的研究關注亞低溫對細胞應激水平的影響。熱休克蛋白家族（HSP）被認為可能參與了大部分低溫調(diào)節(jié)細胞應激，實現(xiàn)保護效應的事件。Terao等^[17]對大鼠大腦中動脈結扎2 h后采取亞低溫處理后發(fā)現(xiàn)，HSP70的水平明顯增加，而且進一步分析發(fā)現(xiàn)，HSP70蛋白mRNA的轉(zhuǎn)錄過程并不受缺血事件影響。但需要注意的是，亞低溫調(diào)控應激水平達到保護作用的假說是基于HSP的抗凋亡與抗炎機制的延伸，因此存在低溫條件下HSP的增加可能僅為一種伴隨現(xiàn)象，而且是否能夠發(fā)揮效應并未獲得嚴格證明。相反，有部分研究則指出，亞低溫反而降低HSP的表達或?qū)ζ錄]有影響^[18-19]。

2 亞急性期效應（<7 d）

缺血性腦損傷再灌注后1～7 d內(nèi)存在第二次損傷的病理生理基礎，這與血流恢復后激活再灌注相關的損傷途徑，如氧自由基產(chǎn)生、炎癥反應等有密切關系。

2.1 減少細胞凋亡

全腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元表現(xiàn)為凋亡為主的細胞死亡方式?，F(xiàn)已證明，亞低溫能夠作用于內(nèi)、外源性的細胞凋亡通路，減少亞急性期神經(jīng)元凋亡產(chǎn)生。

其中，BCL-2家族成員BAX是重要的促凋亡因子，它可以誘導細胞色素c釋放并進一步激活caspase。亞低溫可以降低BAX的表達、增加抗凋亡因子BCL-2的含量，最大限度地抑制下游凋亡級聯(lián)反應的發(fā)生^[20]。此外，蛋白激酶Cδ（PKCδ）也是凋亡通路的重要蛋白，在caspase 3的作用下，PKCδ會從胞漿進入線粒體和細胞核內(nèi)，啟動凋亡過程。Lee等^[21]在大鼠MCAO模型中發(fā)現(xiàn)，在再灌注前15 min和再灌注后15 min分別誘導并維持3 h的30 ℃低溫治療，缺血核心區(qū)和半暗帶中的PKCδ雖然含量變化不明顯，但是其裂解出現(xiàn)減少，阻斷了其向線粒體和胞核的轉(zhuǎn)移。而且，低溫可以保存PKCδ的異構體——PKCε在缺血區(qū)的水平，而這種蛋白在體外被認為具有明顯的神經(jīng)保護作用^[22]。

亞低溫作用于外源性凋亡途徑的主要方式是抑制啟動初始階段蛋白的表達、結合與激活。Liu等^[23]發(fā)現(xiàn)，缺血期的亞低溫可以抑制FAS、MMP和caspase 8的激活，同時最大限度地保存膜結合的FASL蛋白。實際上，亞低溫阻斷FASL的裂解并與MMP、caspase啟動的下游凋亡通路有關。另外，Xu等^[24]通過體外皮層神經(jīng)元模型中找到小幅度降溫作用凋亡初始階段的另外證據(jù)，他發(fā)現(xiàn)JNK和細胞色素c的轉(zhuǎn)移會被同時抑制，從而防止了下游caspase蛋白的激活。

2.2 增加損傷細胞存活機會

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，周圍神經(jīng)細胞會產(chǎn)生一類分子，以期最大限度的拯救受損細胞，這些分子包括腦源性神經(jīng)生長因子（BNDF）、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)生長因子（GDNF）以及神經(jīng)素。它們參與神經(jīng)突觸的重塑、神經(jīng)網(wǎng)絡再造等過程，避免神經(jīng)細胞的結構性損傷事件。Vosler等^[25]在窒息性心搏驟停的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，33 ℃的低溫處理后，大鼠海馬BNDF的外顯子Ⅲ表達明顯增加，雖然缺乏直接證據(jù)，但這提示亞低溫可能會提高BDNF的轉(zhuǎn)錄效率。采取同樣的模型，Cruz等^[26-27]發(fā)現(xiàn)，延遲1 h開始的亞低溫會在24 h時明顯增加大鼠海馬區(qū)的BDNF含量，以及BDNF的受體酪氨酸磷酸化水平。除此之外，BDNF的下游分子如細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）也同時被激活，而ERK則是參與細胞生長、增殖的重要啟動因子。GDNF能夠抑制caspase等促凋亡蛋白形成，刺激神經(jīng)祖細胞產(chǎn)生。Schmidt等^[28]研究發(fā)現(xiàn)，亞低溫對大鼠中樞神經(jīng)不同結構內(nèi)GDNF會產(chǎn)生不同的影響。其中海馬的GDNF在6 h內(nèi)升高，12 h內(nèi)降低，而小腦、腦干的GDNF則在24 h內(nèi)均無明顯變化。這說明不同部位的細胞存在修復不同步現(xiàn)象，亞低溫對缺血損傷敏感區(qū)的保護效應發(fā)揮得較早。

2.3 調(diào)節(jié)氧自由基

缺血再灌注后，腦部會出現(xiàn)快速而短暫的自由基應激。在狗長時間心搏驟停模型中發(fā)現(xiàn)，再灌注后大腦皮質(zhì)的脂質(zhì)過氧化水平進行性增加，并且伴隨有大量脂質(zhì)還原型雙鍵的丟失。而且，這種氧化應激損傷會持續(xù)16～24 h^[29]。進一步地，Katz等^[30]在窒息性心搏驟停大鼠模型中對比了短時程（4 h）、長時程（24 h）體表低溫及藥物調(diào)節(jié)性低溫（神經(jīng)緊張素類似物NT77誘導）對腦部氧化應激效應的影響后發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性亞低溫方法與長時程體表低溫都能夠降低復蘇后48～72 h大鼠海馬丙二醛水平，而短時程低溫則達不到這個效果。Mueller-Burke等^[31]通過窒息性心搏驟停的新生家豬模型模擬了缺血缺氧性腦損傷過程，他們發(fā)現(xiàn)復蘇后的亞低溫可以抑制紋狀體內(nèi)NMDA受體的激活與神經(jīng)元一氧化氮合成酶激活，以及后期蛋白質(zhì)的氧化過程，而這三者被認為與紋狀體細胞的凋亡密切相關。在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，Kuo等^[32]通過頸外靜脈逆行灌注冰凍生理鹽水后發(fā)現(xiàn)，腦部降溫組的氧化應激（超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶降低，丙二醛增高）、硝基化應激損傷（神經(jīng)源性一氧化氮合成酶、3-硝基酪氨酸增高）較常溫組顯著降低，伴隨而來的神經(jīng)保護效應則是大鼠運動功能獲得明顯改善。而最近一項對心肺復蘇后家豬的研究后認為，復蘇后維持12 h的亞低溫可能是通過抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅲ降解以及上調(diào)超氧化物歧化酶MnSOD水平來達到神經(jīng)保護效應^[33]。

2.4 調(diào)控炎癥介質(zhì)

炎癥學說在復蘇后神經(jīng)功能損傷中占有重要的地位。根據(jù)目前的證據(jù)分析，全腦缺血后的炎癥反應主要來自于局部小膠質(zhì)細胞的激活，部分來自于血管壁聚集的白細胞釋放的細胞因子作用^[34-35]。在體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞模型中發(fā)現(xiàn)，低溫處理后的細胞釋放IL-6，IL10及NO水平較常溫及高溫組均顯著降低^[36]。Webster等^[37]通過雙側(cè)頸動脈結扎模擬的大鼠全腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，亞低溫處理在抑制海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞激活基礎上，進一步降低NF-κB的易位和激活。以高遷移率族蛋白B（HMGB1）作為早期炎癥指標，Koda等^[38]研究認為，采取再灌注后亞低溫治療，可以明顯降低這種炎癥因子的表達，獲得與缺氧前亞低溫預處理類似的治療效果。此外，在家豬心肺復蘇模型中也觀察到，單純亞低溫或亞低溫聯(lián)合麻醉劑（七氟醚）均可以降低復蘇后24 h家豬腦皮質(zhì)的細胞因子IL-1β，IL-6，IL-10，TNF-α，ICAM-1水平^[39]。

2.5 調(diào)節(jié)血腦屏障作用

缺血再灌注后血腦屏障（BBB）的破壞構成后期腦水腫、腦出血的病理學基礎。亞低溫可以從組成BBB各個結構來維持其相對正常的生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后即開始的6 h亞低溫治療，可以減少血管基底膜蛋白，聚集蛋白和骨黏連蛋白的丟失，穩(wěn)定血管基底膜結構^[40]。進一步發(fā)現(xiàn)，亞低溫對結構細胞的效應并不僅限于此，借助于亞低溫作用，周細胞等才能夠繼續(xù)依附于血管壁，維持BBB的正常結構。從BBB相關蛋白角度分析發(fā)現(xiàn)，亞低溫可以直接調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和水通道蛋白4（Aqp4）等水平，在防止細胞外基質(zhì)降解，減輕腦水腫等方面，發(fā)揮重要的神經(jīng)保護效應^[41-43]。此外還發(fā)現(xiàn)，亞低溫能夠影響B(tài)BB上多重耐藥蛋白1（MDR1）的表達，這可能會為亞低溫期進一步聯(lián)合藥物治療保護神經(jīng)功能提供研究契機^[44]。

3 遠期效應（≥7 d）

亞低溫治療的最終目的在于最大限度的減輕神經(jīng)損傷，尤其是挽救高級神經(jīng)功能。除了上述對缺血再灌注后短期的影響外，早期介入的亞低溫對長期神經(jīng)功能恢復也表現(xiàn)出促進作用。

3.1 對神經(jīng)元再生影響

研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的中樞神經(jīng)再生能力隨著年齡增長出現(xiàn)減退趨勢。對發(fā)育中的腦組織神經(jīng)干細胞而言，不同的溫度和維持時間可能帶來截然不同的神經(jīng)再生趨勢。Xiong等^[45]在對出生7 d的乳鼠采取結扎單側(cè)頸動脈模擬新生兒缺血缺氧性腦病的模型中發(fā)現(xiàn)，采用32～33 ℃溫度維持24 h，雖然神經(jīng)干細胞（BrdU，Nestin雙標陽性）數(shù)量上與常溫組（36～37 ℃）差異無統(tǒng)計學意義，但是未成熟（BrdU，Tuj-1雙標陽性）與成熟（BrdU，MAP-2雙標陽性）神經(jīng)元數(shù)量均顯著高于常溫缺血組。這提示在神經(jīng)干細胞增殖能力相當?shù)那闆r下，24 h的亞低溫處理更傾向誘導其向神經(jīng)元方向分化。Saito等^[46]對體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞使用32 ℃處理后發(fā)現(xiàn)，這些神經(jīng)干細胞的“干性”亦較常溫組得以保存。

然而也有不少研究者對低溫誘導神經(jīng)元、突觸再生能力持懷疑態(tài)度。采用頸部動脈夾閉的動物模型，Takeshi^[47]發(fā)現(xiàn)30 ℃維持21 h后，乳鼠海馬齒狀回顆粒下層BrdU標記的新生細胞數(shù)量較常溫組不但沒有增加，反而明顯降低了。Silasi等^[48]發(fā)現(xiàn)，全腦缺血后低溫治療除了最大限度的保存了新生顆粒細胞的活性外，并不能增加海馬CA1區(qū)神經(jīng)元再生。此外，他還發(fā)現(xiàn)腦缺血后不同時程的亞低溫（2，4，7 d）對中樞神經(jīng)元再生、突觸形成以及腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）的合成并無顯著影響^[49]。Lasarzik等^[50]比較了常溫和低溫對頸動脈夾閉后大鼠腦組織內(nèi)神經(jīng)細胞再生能力的影響后發(fā)現(xiàn)，腦缺血后第28天的神經(jīng)元再生能力并未從圍缺血期的亞低溫處理中獲益。因此從目前的研究證據(jù)上看，亞低溫對神經(jīng)再生的影響可能存在某一段時間限制的作用時間窗。未在時間窗內(nèi)干預或者超時程干預，都可能會影響亞低溫誘導神經(jīng)再生的效果。

3.2 促進神經(jīng)元突觸連接形成

顯而易見，缺血后腦功能恢復不僅需要神經(jīng)元再生，而且這些新生神經(jīng)元必須能夠重新建立突觸連接，為神經(jīng)沖動形成基本的傳導環(huán)路。對麻醉狀態(tài)下的正常大鼠研究發(fā)現(xiàn)，32 ℃亞低溫處理90 min后，海馬CA1區(qū)長時程增強的群峰電位幅度會較常溫組增加68.4%，而且復溫后仍能維持在131.9%水平，這提示低溫能夠增加海馬的突觸傳遞效應^[51]。最近一項研究采取全基因芯片分析方法發(fā)現(xiàn)，MCAO大鼠經(jīng)過4 h的亞低溫處理，腦內(nèi)N-鈣黏連蛋白（CDH2）基因表達顯著增加，而上調(diào)CDH則被認為是修復神經(jīng)突觸的可能機制之一^[52]。

3.3 膠質(zhì)細胞再生和新生血管形成的影響

目前極少有研究關注低溫對缺血后腦組織內(nèi)膠質(zhì)細胞再生的影響及其在腦功能恢復中的角色。膠質(zhì)細胞再生在不同的模型、不同溫度及實驗條件下，會有截然不同的結果。以少突膠質(zhì)細胞為例，30 ℃低溫會抑制祖細胞的增殖，而33 ℃的低溫則得出相反的結論[48，53]。除此之外，低溫對缺血損傷后期星形膠質(zhì)細胞的影響也不明確。從現(xiàn)象上看，亞低溫在一定程度上會增強中風、創(chuàng)傷性腦損傷模型中的中樞新生血管形成效應^[54-55]，但按照目前證據(jù)，尚無法確定新生血管形成事件與神經(jīng)功能恢復之間的關系。

4 結語

治療性亞低溫對缺血后腦損傷急性期保護作用早已明確，但對亞急性期，尤其是遠期的保護效應機制，依然期待更深入的研究。從基礎研究的角度分析，我們尚需要更多證據(jù)闡明亞低溫對細胞死亡相關的信號傳導方式的影響。

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