長鏈非編碼RNA在運動改善骨質疏松中的作用機制

楊康 陳祥和 趙仁清 余慧琳 張憲亮 卜文倩

(1揚州大學體育學院，江蘇 揚州 225127；2山東大學體育學院)

自20世紀末Xist作為首個調(diào)控性長鏈非編碼RNA(LncRNA)被發(fā)現(xiàn)以來，大量文獻和實驗結果顯示，LncRNA在人類細胞中存在如H19、MEG3、DANCR等多種亞型〔1〕。LncRNA能調(diào)控包括成骨細胞(OB)、破骨細胞(OC)和骨髓間充質干細胞(BMSCs)在內(nèi)的多種細胞進而影響骨代謝進程的研究在國內(nèi)外已有很多，例如LncRNA調(diào)節(jié)miRNA、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)進而影響OB分化，并在骨質疏松(OP)發(fā)生中扮演重要角色〔2〕。有學者通過KEGG PATHWAY對差異表達的去卵巢(OVX)小鼠LncRNA進行分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA參與調(diào)控的Janus激酶信號轉導與轉錄激活子(Jak/STAT)信號通路影響骨細胞的增殖、分化和凋亡〔3〕。此外，LncRNA廣泛參與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、成骨特異性轉錄因子(Runx2)、mTOR等多種下游關鍵因子或與其相關信號通路對骨代謝的調(diào)節(jié)過程〔4〕。而運動能通過機械外力(肌肉收縮和地面反沖擊力)的直接作用影響骨細胞相關信號通路和激素分泌進而調(diào)節(jié)骨代謝。OP常表現(xiàn)為骨量的流失，是一種以骨質減少和微結構退化為特征的全身性骨疾病，多發(fā)于骨組織長期缺少應力刺激和正常機械負荷的因病久臥休息患者、運動功能障礙患者和因性激素缺乏的老年人〔5〕。近來研究發(fā)現(xiàn)，長期缺乏運動會導致骨組織代謝功能下降，OP發(fā)病風險升高〔6〕。Ma等〔7〕研究發(fā)現(xiàn)，OP發(fā)生是通過啟動C-jun氨基末端激酶/轉錄因子激活蛋白(JNK/AP)-1信號通路使OC分化和融核增加，增強骨吸收，而運動會抑制JNK/AP-1信號通路，使OC分化和融核減少，進而抑制骨吸收。此外，有研究報導，骨保護素-核因子κB受體活化因子配體-核因子κB受體活化因子(OPG-RANKL-RANK)系統(tǒng)相關細胞因子表達改變OP機體骨髓微環(huán)境促進OC分化〔8〕。

目前對OP發(fā)生機制及其改善預防多集中于運動和OP的表層關系方面，而探討更深的分子微觀層次的研究如LncRNA在運動改善OP中的作用和機制的研究還很鮮見。LncRNA作為調(diào)控骨組織代謝的重要因子，通過運動的手段，是否存在某種機制使其對骨組織產(chǎn)生影響，進而改善OP？本文對近年來LncRNA、運動和OP三者相關文獻進行綜述。

1 LncRNA及其生物學作用

轉錄生成非編碼RNA(ncRNA)序列約占人類基因組的91%，其中包括housekeeping非編碼RNA、小分子非編碼RNA、中等長度非編碼RNA和LncRNA〔9〕。LncRNA是一種長度超過200核苷酸的RNA分子，但不具備編碼蛋白質的功能。LncRNA在細胞增殖分化、個體發(fā)育、信號轉導、干細胞維持、代謝等重要生命活動中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用，能直接作用于骨形成標記蛋白，調(diào)控BMSCs向OB分化〔10〕。其在表觀遺傳水平、轉錄水平和轉錄后水平等方面具有控制基因表達的作用。此外，腫瘤、糖尿病、精神疾病和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生都與LncRNA的異常表達有關〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA在骨細胞的生長發(fā)育與分化過程中意義重大，以順式和反式作用參與并作用于骨細胞分裂、劑量補償和細胞分化等過程〔12〕。

LncRNA功能發(fā)揮離不開其特有的分子結構，一級結構——核苷酸排列順序(堿基互補配對)是LncRNA調(diào)節(jié)靶基因及其上下游基因轉錄、翻譯的基礎〔13〕。其能作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)占據(jù)靶基因的結合位點，抑制下游miRNA或mRNA與靶基因結合(也有學者將此行為稱為靶基因模仿)〔14〕。如與腫瘤發(fā)生相關的LncRNA生長阻滯特異轉錄物(Gas)5被證明能結合糖皮質激素的DNA結合域，競爭糖皮質激素反應元件目的基因并調(diào)節(jié)其表達〔15〕。這種競爭結合靶基因位點的方式在肌肉分化中也有所體現(xiàn)，基因間長鏈非編碼RNA-MD(Linc-MD)1通過堿基互補配對的方式與miR-133和miR-135結合，競爭性抑制二者與靶基因的結合，進而發(fā)揮調(diào)節(jié)肌肉分化的作用〔16〕。LncRNA二級結構及三級結構(空間結構)是LncRNA 發(fā)揮其功能的中樞〔17〕。但目前有關LncRNA二級結構及三級結構在骨細胞分化方面的研究報導較少。Zuo等〔18〕采用RNAfold軟件預測LncRNA AK089560二級結構，借助qRT-PCR 檢測誘導前后不同時間點AK089560表達的變化，發(fā)現(xiàn)LncRNA AK089560呈現(xiàn)為復雜莖環(huán)結構，且在成骨分化第2、4、6天表達明顯下降，與編碼基因Sema3a形成sense overlap關系，與sense overlap同向轉錄表達。這表明二級結構莖環(huán)的AK089560在間質干細胞成骨分化中下調(diào)表達，顯示二級結構的LncRNA可能參與調(diào)控BMSCs多向分化。而目前證明通過調(diào)控鄰近編碼基因表達是許多LncRNA重要的作用方式之一〔19〕。而LncRNA AK089560以同樣的方式影響鄰近編碼基因Sema3a表達，進而調(diào)節(jié)BMSCs分化。

2 LncRNA在OP中的表達

OP常表現(xiàn)為骨微細結構受損，骨礦物成分和骨基質減少等特征，發(fā)病時皮質骨薄化和骨小梁數(shù)量下降趨勢明顯。研究發(fā)現(xiàn)，OP常伴隨LncRNA的異常表達，而這些異常表達是否是導致OP發(fā)病的機制呢？針對此問題，許多學者以不同的方式進行了研究論證。Li等〔20〕研究LncRNA-H19在失用性骨質疏松(DOP)發(fā)病中的作用時，發(fā)現(xiàn)LncRNA-H19通過競爭性抑制miR-29B-3P而調(diào)控Lrp6表達，進而調(diào)節(jié)Wnt通路功能而參與DOP發(fā)病。有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3可參與調(diào)控BMSC分化，其在OVX小鼠模型和絕經(jīng)后OP(POP)患者的BMSC中表達上調(diào)，在誘導BMSC向成骨分化的過程中其表達下調(diào)，其主要通過下調(diào)miR-133a-3p來抑制成骨分化〔21〕。此外，基因間LncRNA uc431+(lincRNA uc431+)及其靶基因ClCF1在POP中表達下調(diào)，表明lincRNA uc431+能負向調(diào)節(jié)靶基因CLCF1〔22〕。Hu等〔23〕在用qRT-PCR分析OP患者血液樣本時，發(fā)現(xiàn)LncRNA DANCR表達顯著上調(diào)，而LncRNA DANCR本身具備提高炎性因子白細胞介素(IL)-6和TNF-α的mRNA表達水平及蛋白表達水平的功能。這提示，LncRNA DANCR能以調(diào)控炎癥因子的方式參與OP發(fā)病。有學者在研究OVX小鼠下頜骨OP相關LncRNA異常表達時，發(fā)現(xiàn)LncRNA-mmu-16032-P1428960544與LncRNA-mmu-6597-P1428991的過表達，會通過過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ和胰島素信號通路使OVX小鼠的骨量減少，并加速OC分化〔24〕。陳娟等〔25〕采用genechip技術觀察POP腎陰虛證患者外周血液中單個核細胞LncRNA表達水平，在與POP腎陽虛證組和正常對照組對比后，發(fā)現(xiàn)前者LncRNA LINC00189表達下調(diào)，LncRNA LOC101929378表達上調(diào)，并推測LncRNA LINC00189、LncRNA LOC101929378可能通過調(diào)控Jak/STAT、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、胰島素通路和鈣離子代謝等信號通路參與POP發(fā)病。以上均表明OP發(fā)病與LncRNA異常表達有關。筆者通過對近年來相關文獻的整理，發(fā)現(xiàn)LncRNA在幾種OP中存在以下幾種表達，表明OP發(fā)生可能與LncRNA的異常表達有關。

3 LncRNA在運動改善OP中的作用機制

3.1LncRNA介導運動調(diào)控BMSCs 骨形成與骨吸收所共同構成的骨骼內(nèi)動態(tài)平衡是維持人體骨質穩(wěn)定的重要基礎，當由OC主導的骨吸收分化速率大于OB時，OP也就隨之發(fā)生。而OB自BMSCs分化而來，后者在骨代謝中的作用不言而喻。近年來有關通過間質干細胞移植的方式以增加OB數(shù)目，增強OB功能進而改善OP的研究逐漸增多，且已有研究證明此法可行且有效〔26〕。

而LncRNA憑借其二級結構或空間結構為類似于Runx2此類的骨形成標志蛋白和靶標識別提供了更多潛在的可能性〔27〕。LncRNA能直接作用于骨形成標記蛋白，進而來調(diào)節(jié)成骨分化過程。Zhang等〔28〕在誘導人BMSCs向OB分化時發(fā)現(xiàn)，LncRNA XR-11050在OB成骨分化的過程中表達上調(diào)，其過表達促進了Runx2表達，進而影響下游骨形成相關蛋白基因表達，最終促進BMSCs向OB分化。此發(fā)現(xiàn)證明存在這樣一種機制使得LncRNA XR-11050能激活Runx2及其下游相關因子，動員BMSCs的成骨分化。Cao等〔29〕通過過表達LncRNA ak028326或CXCL13降低了高糖環(huán)境對小鼠BMSCs成骨分化的抑制影響，并發(fā)現(xiàn)后者可正調(diào)控前者的基因表達。這表明LncRNA ak028326可通過調(diào)控CXCL13表達，以動員BMSCs向OB分化。王雅琦〔30〕利用siRNA轉染技術對人腫瘤細胞系進行轉染，下調(diào)LncRNA BCYRN1表達，發(fā)現(xiàn)LncRNA BCYRN1能正向調(diào)控Wnt/β-Catenin通路，提高Wnt信號通路及其下游相關蛋白表達。而Wnt蛋白本就具有調(diào)節(jié)細胞增殖、分化等生物學功能〔31〕。且已有研究顯示W(wǎng)nt蛋白及其下游信號通路在間充質干細胞的增殖及分化過程中發(fā)揮重要作用〔32〕。因此推測，LncRNA可能在運動影響下通過正向調(diào)節(jié)Wnt通路，影響B(tài)MSCs的增殖與分化。

此外，Wang等〔33〕在比較BMSCs與向軟骨誘導分化14 d后的細胞時發(fā)現(xiàn)，其在向ZBED3-AS1和CTA-941F9.9在向軟骨誘導分化7 d時顯著增高，在14 d時達到頂峰，并持續(xù)到28 d軟骨誘導分化的細胞中有2 166條LncRNA上調(diào)，1 472條LncRNA下調(diào)。這一現(xiàn)象表明LncRNA在BMSCs向軟骨分化的初期發(fā)揮關鍵調(diào)節(jié)作用。Xie等〔34〕誘導BMSCs成骨分化10 d，LncRNA芯片及相關分析得出520條LncRNA和665條mRNA差異性表達，包括轉化生長因子(TGF)-β的64個信號通路有明顯差異，4個具有明顯差異表達的LncRNA(ZNF354A-1、LIN54-1、FRG2C-3和USP50-2)使BMSCs成骨分化異常，加速脊髓灰質炎病變。有學者對比SHAM組小鼠和SHAM+EX組小鼠的LncRNA發(fā)現(xiàn)，與前者相比，后者有64條LncRNA表達上調(diào)，161條LncRNA表達下調(diào)〔35〕。這表明運動能對LncRNA表達產(chǎn)生影響。據(jù)此推測，運動可能通過影響LncRNA表達，經(jīng)過Runx2、CXCL13和Wnt信號通路及其下游因子調(diào)控BMSCs增殖與分化。

3.2LncRNA介導運動調(diào)控OB分化及骨形成 OB是骨形成的主導細胞，其增殖、分化和活性直接關系到骨代謝進程。miRNA是18-23nt的高度保守的非編碼單鏈RNA，在OB分化過程中的作用不容小覷〔36〕。通過整理查閱相關文獻，發(fā)現(xiàn)LncRNA與miRNA之間存在互相調(diào)控的關系，一方面，LncRNA可作為內(nèi)源性miRNA海綿前體結構，通過與miRNA競爭結合靶基因mRNA的3′-非編碼區(qū)域(UTR)，間接負向抑制miRNA對靶基因mRNA的調(diào)控，即LncRNA可作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)通過miRNA應答元件(MRE)競爭結合具有相同MRE的miRNA調(diào)控基因表達〔37〕；另一方面，由于此兩者結構的類似，miRNA會通過所謂“種子序列”結合靶基因mRNA的3′-UTR，根據(jù)堿基互補配對特異性原則識別靶標，占據(jù)LncRNA與靶基因的結合位點，以達到抑制其生物學功能的目的。例如：miR-21能通過Argonaute2蛋白(Ago2)途徑調(diào)控LncRNA表達〔38〕。而miRNAs可通過與BMPs特異性結合的方式，影響OB。Li等〔39〕在研究BMP-2誘導小鼠ST2細胞向OB分化時，發(fā)現(xiàn)miR-2861表達上調(diào)，而過表達miR-2861會增加BMP-2誘導分化能力，之后的深入研究發(fā)現(xiàn)，其機制是下調(diào)組蛋白脫乙酰氨(HDAC5)表達，進而抑制Runx2降解，促進OB分化。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-210可負向調(diào)控BMP-4來抑制人活化素A受體-IB(AcvR1B)蛋白表達，從而抑制TGF-β/activin信號通路以促進ST2細胞向OB分化〔40〕。以上均表明，miRNA過表達可增加BMPs調(diào)節(jié)的成骨細胞生化標志物Runx2產(chǎn)生，或抑制TGF-β/activin通路，進而加速ST2成骨分化。無獨有偶，Wnt信號通路和Runx2也在誘導成骨分化過程中發(fā)揮作用。Liu等〔41〕研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-9對C2C12 細胞的Dickkopf相關蛋白(DKK)1蛋白表達水平明顯下降，激活Wnt通路，使成骨分化相關基因Ⅰ型膠原蛋白(Col Ⅰ)，骨鈣素(OCN)，骨唾液酸蛋白(BSP)表達上調(diào)。新近研究顯示，細胞在成骨分化過程中Dicer和Runx2表達均上調(diào)，熒光素酶實驗表明Runx2能促進Dicer表達，而Dicer的上調(diào)進一步促進成骨誘導相關miRNA表達上調(diào)〔42〕。因此，LncRNA可作為ceRNA負向調(diào)控miRNA，下調(diào)miRNA的表達進而提高BMPs、Runx2、Wnt通路及其下游相關因子的產(chǎn)生，最終使OB分化增加。而運動可對LncRNA 產(chǎn)生影響。郭健民〔35〕研究證明，中等強度的跑臺運動能顯著提高OP小鼠的骨密度，提高其骨形成速率和骨強度；同時可以對小鼠骨LncRNA產(chǎn)生一定的影響，造成其表達的升高或降低，例如：LncRNA Gm31126、LncRNA Loc105243692、LncRNA Gm11651等上調(diào)明顯，LncRNA 105247265等下調(diào)顯著。因此推測，運動能通過影響LncRNA表達，負向調(diào)控miRNA，進而影響B(tài)MPs、Runx2、Wnt通路及其下游分子，最終促進成骨分化。

3.3LncRNA介導運動調(diào)控OC分化及骨吸收 由OC主導的骨吸收，一旦功能過度增強，骨骼內(nèi)的動態(tài)平衡變化向骨吸收方向偏移，導致骨質疏松發(fā)生。mTOR是骨代謝和骨自噬的主要途徑。mTOR細胞信號轉導主要經(jīng)由磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)/mTOR和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/mTOR路徑，通過這兩條通路調(diào)節(jié)骨細胞代謝、增殖、存活與死亡，并與骨細胞自噬緊密相關〔43〕。目前已有研究證明，在腫瘤細胞中，LncRNA能對mTOR進行調(diào)控。LncRNA GAS5基因是一種核仁小分子RNA(snoRNA)的宿主基因，位于人類染色體lq25，長度630 nt〔44〕。Jafari Ghods等〔45〕研究發(fā)現(xiàn)，沉默LncRNA GAS5的雄激素依賴(Lncap)和雄激素敏感(22Rv1)可使其對mTOR抑制劑的敏感性下降，轉染LncRNA GAS5的雄激素非依賴的PC-3和DU145可增加其對mTOR抑制劑的敏感性。此外，基因間長鏈非編碼RNA-P21(lincRNA-p21)lincRNA-p21是瓦伯格效應的調(diào)節(jié)因子之一。有學者發(fā)現(xiàn)mTOR可在乳腺癌細胞中磷酸化熱休克因子(HSF)1，提高HSF1依賴的RNA結合蛋白(HUR)的表達，進而控制lincRNA-p21的表達，促進腫瘤的發(fā)生〔46〕。以上表明，LncRNA可在腫瘤細胞中對mTOR進行調(diào)控，而此機制可能同樣存在于骨組織細胞中。而mTOR抑制劑能抑制OC的活性與形成，阻止OVX引起的骨量丟失。因此，LncRNA可能在運動影響下表達上調(diào)，增加其對mTOR抑制劑的敏感性以抑制OC生成〔47〕。

此外，與LncRNA通過競爭結合miRNA靶細胞的結合位點，調(diào)控成骨分化類似，LncRNA能以相仿的方式影響OC。Krzeszinski等〔48〕在OVX小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，miR-34a相關處理能顯著改善小鼠骨吸收過強引起的骨量丟失，Tgif2可通過RANKL相關轉錄因子正反饋調(diào)節(jié)其本身及其相關因子的表達，加速OC的形成與分化。miR-34a能夠與Tgif2的mRNA的3′-UTR結合，抑制其促進破骨細胞分化的功能，從而減少骨吸收，達到改善骨質疏松的目的。與RANKL緊密關聯(lián)的RANK-RANKL通路在骨吸收和骨質疏松發(fā)生中發(fā)揮重要作用，RANK與其受體RANKL在前體OC表面結合，會加速多核巨細胞向OC分化。miR-106b能和RANKL的3′-UTR，下調(diào)其表達，抑制前體破骨細胞聚合，減少OC分化〔49〕。因此筆者推測，存在這樣一條機制：運動降低部分LncRNA表達，使其減少與miRNA的競爭，加速miR-34a和miR-106b分別與Tgif2和RANKL的3′端結合，進而抑制OC分化。