人C型溶菌酶發(fā)酵與分離純化工藝的研究

王林濤 姚笛

摘要 [目的]研究畢赤酵母菌株（Pichia GS115）表達(dá)人C型溶菌酶（HLYZ）的發(fā)酵與分離純化的工藝。[方法]探討酵母生長規(guī)律，研究不同菌體濃度、不同誘導(dǎo)時間對蛋白產(chǎn)量的影響，并且探討不同pH條件對DEAESepharose FF和CMSepharose FF層析分離純化目標(biāo)蛋白的影響。[結(jié)果] 畢赤酵母菌株表達(dá)HLYZ的最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵24 h用濃度1%甲醇誘導(dǎo)，以后每12 h用濃度1%甲醇誘導(dǎo)，共6次，在此條件下可獲得高產(chǎn)量目標(biāo)蛋白。DEAESepharose FF和CMSepharose FF分離純化目標(biāo)蛋白的最佳pH 分別為6.65和6.50。[結(jié)論]該研究可為人C型溶菌酶的工藝化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 人C型溶菌酶；畢赤酵母；發(fā)酵；DEAE與CM層析

中圖分類號 S188+.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）31-10836-03

Study of the Human Ctype Lysozyme Fermentation， Separation and Purification

WANG Lintao1， YAO Di2

（1. School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200433； 2. Changzhou Technican College， Changzhou， Jiangsu 213017）

Abstract [Objective] To study the fermentation， separation and purification of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）. [Method] The effections of different cell concentration and different induction time on the protein production were investigated. The effection of the pH conditions on the DEAESepharose FF and CMSepharose FF chromatography separation and purification of the target protein were also investigated. [Result] It was found that optimal fermentation conditions for human ctype lysozyme were as follows： induction with 1% methanol after 24 h fermentation， next， induction with 1% methanol every 12 h， six times. Under the above conditions， high yield of the target proteins were obtained. The optimal pH conditions for the DEAESepharose FF and CMSepharose FF separation and purification are 6.65 and 6.5. [Conclusion] The research provides theoretical guidance for the industrial production of human ctype lysozyme from Pichia yeast strain （Pichia GS115）.

Key words Human ctype lysozyme； Pichia yeast； Fermentation； DEAESepharose FF and CMSepharose FF

C型人溶菌酶（HLYZ）由英國著名科學(xué)家弗萊明^[1]發(fā)現(xiàn)，是一種1，4βN溶菌酶。它切割細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖N乙酰胞壁酸（MurNAc）和N乙酰葡萄糖胺（GlcNAcC4）之間的糖苷鍵，破壞肽聚糖骨架，在細(xì)菌內(nèi)部滲透壓作用下導(dǎo)致細(xì)菌破裂達(dá)到殺菌效果^[2]。HLYZ廣泛存在于人體的體液、細(xì)胞及組織器官中^[3]，可見其對人體的重要性。HLYZ有著獨(dú)特的優(yōu)越性和非常多的藥理作用，具有多重臨床應(yīng)用價值^[4-8]。鑒于其重要的生理作用，目前國外對HLYZ的制備過程進(jìn)行了廣泛的研究與開發(fā)，所采用的HLYZ表達(dá)的宿主菌大多為畢赤酵母GS115菌株，以pPIC9K為載體，可以獲得對HLYZ的高表達(dá)^[9]。

國內(nèi)采用畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)HLYZ的報(bào)道較少，有利用大腸桿茵、酵母茵和真茵表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)HLYZ，最高水平為40 mg/L^[10]。筆者采用畢赤酵母GS115菌株表達(dá)HLYZ，分別研究不同菌體濃度、不同誘導(dǎo)時間對蛋白產(chǎn)量的影響，得出可獲得高產(chǎn)量HLYZ的發(fā)酵條件。近年來，有利用離子交換層析分離純化人溶菌酶研究的報(bào)道^[11-12]。筆者在不同pH條件下對HLYZ進(jìn)行DEAESepharose FF及CMSepharose FF層析分離純化研究。在SDSPAGE電泳檢測結(jié)果，清晰可見單一目標(biāo)蛋白條帶，分離純化效果非常好。該研究為實(shí)現(xiàn)HLYZ規(guī)?；a(chǎn)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。含pPIC9K/HLYZ載體的畢赤酵母菌GS115HLYZ重組菌株，由研究室構(gòu)建和保存；HLYZ活性測定用溶壁微球菌AS 1.634，購自中國科學(xué)院微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基為YPDG418培養(yǎng)基，組成為：蛋白胨2%，酵母提取物1%，葡萄糖2%，瓊脂2%；搖瓶和發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY培養(yǎng)基，組成為：蛋白胨2%，酵母提取物1%，磷酸緩沖液0.1mol/L（pH 6.0），酵母氮源培養(yǎng)基（YNB）1.34%，生物素0.4 mg/L，甘油2%。

1.1.3 層析劑。DEAESepharose FF，CMSepharose FF，購自GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)。

從-70 ℃冷凍冰箱取出冷凍菌液，接種于YPDG418斜面上培養(yǎng)24 h，接一級種于120 ℃、20 min滅菌的裝量為500 ml BMGY培養(yǎng)基的2 000 ml三角搖瓶中，30 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)16 h。

1.2.2 發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)。將500 ml搖瓶種子接種到120 ℃，20 min滅菌的裝量10 L BMGY培養(yǎng)基的15 L發(fā)酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵溫度30 ℃，pH用濃度12%氨水、2 mol/L鹽酸控制在5.5，溶解氧（DO）控制在10%～15%相對飽和濃度，細(xì)胞生長36 h或24 h后加濃度1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)HLYZ蛋白，其后定時多次加濃度1%甲醇誘導(dǎo)。

1.2.3 分析方法。

1.2.3.1 菌體量的測定。以純水為對照，發(fā)酵液稀釋后在波長600 nm處比色，測定吸光度。

1.2.3.2 HLYZ活性的測定。將搖瓶培養(yǎng)的溶壁微球菌懸混于0.1 mol/L PBS中，配制成光密度為1.0（可見光分光光度計(jì)測定，λ530）濃度的菌體溶液。取畢赤酵母發(fā)酵液離心上清液0.75 ml于裝有3 ml已配制的恒溫30 ℃的溶壁微球菌的比色皿中，立即搖勻，記錄可見光分光光度計(jì)（λ430）1 min的光密度數(shù)變化。酶活單位為光密度每下降0.001即為一個酶活單位。

1.2.3.3 分離純化HLYZ得率的計(jì)算。分離、純化后得到的收集液HLYZ活性總量與分離前樣品HLYZ活性總量之比。

1.2.3.4 目標(biāo)蛋白分子量的測定。采用SDSPAGE電泳，測定分離純化溶液過程中目標(biāo)蛋白。

1.2.4 發(fā)酵液預(yù)處理。

發(fā)酵結(jié)束后立即4 ℃，4 000 r/min離心分離菌體，取上清液于-18 ℃冰箱保存。

1.2.5 DEAE sepharose層析分離純化。DEAESepharose FF粉狀顆粒經(jīng)0.1 mol/L PBS（pH 7.5）溶液平衡2 h，裝柱（10 mm×220 mm），在BioRad常壓層析儀上層析，10 ml發(fā)酵液上柱，速度1 ml/min，收集流出液，在λ280處測定出峰的流出液HLYZ活性，合并活性收集液。

1.2.6 CMSepharose FF層析分離純化。

CMSepharose FF粉狀顆粒經(jīng)0.1 mol/L PBS（pH 7.5）溶液平衡2 h，裝柱（10 mm×220 mm），在BioRad常壓層析儀上層析，20 ml DEAESepharose FF收集液上柱，速度1 ml/min，用pH 7.5 PBS沖洗，直至沖完所有出峰，不收集；用2 mol/L NaCl的pH 7.5 PBS洗脫柱，收集第2個出峰。在λ280處測定第2個出峰的流出液HLYZ活性，合并活性收集液。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件及HLYZ產(chǎn)量

2.1.1 菌體濃度對HLYZ產(chǎn)量的影響。

BMGY培養(yǎng)基發(fā)酵，菌體培養(yǎng)36 h后每24 h加濃度1%甲醇誘導(dǎo)，測定菌體濃度和HLYZ活性。BMGY培養(yǎng)基中碳氮比不合適，使得菌體濃度生長受到限制。在BMGY基礎(chǔ)上流加甘油，直至菌體生長到最大濃度，在較高菌體濃度下誘導(dǎo)HLYZ表達(dá)。從圖1和圖2可以看出，在菌體濃度A600達(dá)到32時比A600 達(dá)到15時HLYZ活性高出1.8倍。因此，在發(fā)酵菌體高濃度下HLYZ產(chǎn)量增加。

2.1.2 誘導(dǎo)時間對HLYZ產(chǎn)量的影響。

HLYZ活性在誘導(dǎo)12 h后不再增加，甚至活性出現(xiàn)下降。這可能是HLYZ被蛋白酶分解的原因。因此，在菌體生長24 h達(dá)到最高濃度后開始誘導(dǎo)，每12 h誘導(dǎo)1次，直至誘導(dǎo)后HLYZ活性不再增加。從圖3可以看出，在對甲醇誘導(dǎo)時間縮短至12 h以及增加誘導(dǎo)次數(shù)的情況下，HLYZ產(chǎn)量大大提高，在同等菌體濃度下發(fā)酵產(chǎn)量提高1.6倍。

2.2 HLYZ分離純化

2.2.1 DEAESepharose FF分離純化。

離子交換層析分離蛋白質(zhì)離子時pH對分離效果、得率有很大的影響。在不同pH下對發(fā)酵液進(jìn)行蛋白層析分離。

從表1可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著pH的提高，HLYZ活性先上升，在pH 6.65左右達(dá)到較高值，此時目標(biāo)蛋白得率最高。蛋白質(zhì)分離效果見圖4。

2.2.2 CMSepharose FF分離純化。

從表2可以看出，在其他條件不變的情況下，隨著pH的提高，HLYZ活性先上升，在pH6.5左右達(dá)到較高值，此時目標(biāo)蛋白得率最高。圖5顯示蛋白分離效果。CM分離純化后SDSPAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測見圖6。

3 結(jié)論與討論

通過不同菌體濃度、甲醇誘導(dǎo)時間2個因素對HLYZ發(fā)

酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵菌體高濃度下HLYZ產(chǎn)量增加。在將甲醇誘導(dǎo)時間縮短至12 h以及增加誘導(dǎo)次數(shù)的情況下，HLYZ產(chǎn)量大大提高，在同等菌體濃度下發(fā)酵產(chǎn)量提高1.6倍。在發(fā)酵過程中影響HLYZ產(chǎn)量的因素還有很多，如碳源、氮源濃度、pH、溫度等。該研究僅對菌體濃度及甲醇誘導(dǎo)時間2個因素加以分析，因此想要規(guī)?；a(chǎn)HLYZ，還有待進(jìn)一步分析。

利用DEAESepharose FF和CMSepharose FF在不同pH下對HLYZ進(jìn)行分離純化。研究表明，在 pH 6.65下DEAESepharose FF和pH 6.5下CMSepharose FF對目標(biāo)蛋白分離純化得率最高；DEAESepharose FF分離純化雜峰較多，進(jìn)一步進(jìn)行CMSepharose FF層析僅一個雜峰。經(jīng)DEAE和CM分離純化后，通過SDSPAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測，發(fā)現(xiàn)在14.6 kDa處有一條清晰可見的單一條帶，幾乎沒有其他雜帶，說明分離效果非常好，最后經(jīng)過冷凍干燥得到蛋白凍干粉，其比活可以達(dá)到52 000 U/mg。

參考文獻(xiàn)

[1] FLEMING A.On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretion [J].Proc RSoc Land B Biol，1922，93：306-317.

[2] FORD L D，JOHNSON L N，MACHIN P A，et al.Crystal streucture of a lysozymetetrasaccharide lactone complex [J].Mol Biol，1974，8：349.

[3] 常凱，馬亮.溶菌酶提取工藝及其在山核桃乳中的應(yīng)用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14883.

[4] SHIGERU M，MASATO K，MASANORI N.Secretion of active human lysozyme by Acremonium chrysogenum using a Fusarium alkaline protease promoter system[J].Journal of Biotechnology，1995，42（1）：1-8.

[5] 王利娟，劉譽(yù).溶菌酶及其晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）與糖尿病并發(fā)癥的研究[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2010，17（5）：157-158.

[6] OSSERMAN E，KLOCKARS M，HALPER G，et al.Effects of lysozyme on normal and transformed mammalian cells[J].Nature，1973，243（5406）：331-335.

[7] WARREN J，RINEHART J，ZWILLING B，et al.Lysozyme enhancement of tumor cell immunoprotection in a murine fibrosarcoma[J].Cancer Res，1981，41（5）：1642-1645.

[8] WOOLEY R E，SCHALL W D，EAGON R G，et al.Efficacy of EDTATrislysozyme lavage in the trentment of experimentally in induced Pseudomonas aeruginosa cystitis in the dog[J].Am J Vet Res，1974，35（1）：27-29.

[9] MURAKAMI M，JIGAMI Y，TANAKA H，et al.Expression of synthetic human lysozyme gene in Escherichia coli [J].Agricultural Biological Chemistry，1986，50：713-723.

[10] 王佃亮.重組人溶菌酶研究進(jìn)展[J].中國生物工程雜志，2003，23（9）：59-60.

[11] 常景立，汪少蕓，周建武，等.苦瓜溶茵酶的分離純化及特性研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2009，9（5）：56-58.

[12] 李英輝，叢麗娜，朱蓓薇.海參腸中溶菌酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27（3）：194-195.