水產(chǎn)品中弧菌的PCR技術檢測研究進展

桑燕嬌 寧喜斌

摘要 水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌均是食源性致病菌，對這些菌種靈敏、快速的檢測方法對水產(chǎn)品安全以及保護人類健康極為重要。主要綜述了水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌的分子生物學檢測研究進展。

關鍵詞 副溶血性弧菌;溶藻弧菌;創(chuàng)傷弧菌;PCR技術

中圖分類號 S986.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11871-04

Research Progress of PCR Technology Detection of Vibrio in Aquatic Products

SANG Yan-jiao， NING Xi-bin*

（Shanghai Ocean University， Shanghai 201306）

Abstract Vibrio parahaemolyticus， Vibrio alginolyticus， Vibrio vulnificus in aquatic products are foodborne pathogens. Sensitive， rapid detection methods for seafood safety and the protection of human health is extremely important. This paper summarizes that research progress of molecular biology detection of Vibrio parahaemolyticus， Vibrio alginolyticus， Vibrio vulnificus in aquatic products.

Key words Vibrio parahaemolyticus; Vibrio alginolyticus; Vibrio vulnificus; PCR technology

基金項目 上海市科委工程中心建設項目（11DZ2280300）;上海市精品課程資助項目。

作者簡介 桑燕嬌（1990-），女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：食品安全。*通訊作者，教授，博士，從事食品安全、微生物學研究。

收稿日期 2014-10-15

水產(chǎn)品由于其具有豐富的營養(yǎng)、鮮美的味道、脂肪含量低、蛋白質含量高等特點，已成為風靡全球的健康食品，且食用的地區(qū)及人群在不斷擴大[1]，因此它的安全性得到了很大的關注。水產(chǎn)品易受到不同程度的污染，其中受到弧菌污染比較嚴重，所以對水產(chǎn)品中微生物的分析和監(jiān)控，能使水產(chǎn)品的質量和安全性得到提高[2]。

目前檢測弧菌的方法有傳統(tǒng)的生理生化測定;分子生物學技術，如LAMP、PCR檢測技術，核酸探針技術，16sRNA檢測技術等;免疫學方法，如ELISA技術、Western blot、免疫熒光技術等[3];傳感器技術，如電化學技術、電子鼻技術等。筆者主要綜述PCR技術檢測水產(chǎn)品中副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌的研究進展。

1 水產(chǎn)品中弧菌概述

弧菌是一類重要的食源性致病菌，廣泛分布于水產(chǎn)品中，是水生動物弧菌病的病原體，主要引起人體腸道疾病、傷口感染和敗血癥等病癥[3]。

1.1 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是革蘭氏陰性嗜鹽菌，隸屬弧菌科中的弧菌屬，它是一種人畜共患病菌[4]。其主要致病性在于它可以產(chǎn)生3種溶血性毒素，分別為不耐熱溶血毒素（thermolabile hemolysin，TLH）、耐熱直接溶血毒素（thermostable direct hemolysin，TDH）和耐熱相關直接溶血毒素（thermostable related hemolysin，TRH），分別由tlh、tdh、trh基因編碼。

人若食用了受該菌污染的水產(chǎn)品后，會引發(fā)食物中毒，主要癥狀為腹瀉、腸痙攣、惡心等典型腸胃炎反應，嚴重者可引起敗血癥[5]。根據(jù)國家食源性疾病監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示[6]，副溶血性弧菌引起的食物中毒，在發(fā)生規(guī)模及人群暴露規(guī)模呈明顯上升趨勢，已經(jīng)高居微生物性食物中毒首位。

1.2 溶藻弧菌

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）又名解藻阮酸弧菌、解藻酸弧菌或解藻阮酸貝內克氏菌，是革蘭氏陰性短桿菌，隸屬弧菌科中的弧菌屬，為嗜鹽嗜溫性、兼性厭氧菌[7]，是一種人和海洋動物共感染的病原菌[8-9]。溶藻弧菌廣泛分布于海洋及江河入海口水域，并且數(shù)量居海水類弧菌之首[10]，但由于其是嗜溫菌，因此從夏季到冬季，由赤道向兩極隨著溫度的降低其數(shù)量也明顯減少[11-12]。此外，在海洋動物中也存在著大量的溶藻弧菌[13]。

溶藻弧菌的致病性主要取決于弧菌與宿主細胞之間的相互作用，其致病過程包括粘附、侵襲、體內增殖及產(chǎn)生毒素等[14]。溶藻弧菌的致病作用主要與它產(chǎn)生的各種毒力因子有關，其毒力因子主要有粘附素、胞外產(chǎn)物（如堿性絲氨酸蛋白酶和膠原蛋白酶等）、外膜蛋白及攝鐵系統(tǒng)等[15-16]。

1.3 創(chuàng)傷弧菌

創(chuàng)傷弧菌（vibrio vulnificus）是一種帶有莢膜的革蘭氏陰性嗜鹽菌，屬于弧菌屬第五群，與霍亂弧菌、腸炎弧菌同屬致病性弧菌，廣泛分布于蝦類、魚類及貝母類等水生動物體內[17]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，人一旦感染了創(chuàng)傷弧菌，短時間內會引起傷口炎癥，嚴重時會導致敗血癥，而且發(fā)病迅速，死亡率較高[18]，尤其是對于已經(jīng)患有肝壞死、慢性腎功能衰竭和免疫功能低下以及有糖尿病病史的患者[19]。

根據(jù)創(chuàng)傷弧菌的生化、遺傳、血清學試驗的差異和受感染宿主的不同，將其分為3種生物型[20-21]。生物型I產(chǎn)吲哚，人類感染通常表現(xiàn)為散發(fā)形式，且?guī)缀醵际怯捎谏镄虸所致;生物型II不產(chǎn)吲哚，是魚類的重要病原菌，特別是對鰻魚的感染性很強，但后來Amaro等試驗證實，它也是人類疾病的條件致病菌[22];生物型III于1996 年首次報道可引起人類敗血癥和軟組織感染[23]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌的致病因子主要有細胞外蛋白酶、彈性蛋白酶、金屬蛋白酶、溶細胞毒素等。

2 PCR技術的研究進展

PCR是1985年由美國Kary Mullis等首創(chuàng)并由美國Cetus公司開發(fā)的一項體外擴增DNA的方法，應用該方法可使極微量的特定DNA片斷在幾小時內迅速擴增至百萬倍[24]。PCR技術具有靈敏度高、快速準確、特異性強、應用范圍廣等優(yōu)點[24]。隨著人們對于食品安全問題越來越重視，PCR技術在食品中的應用得到了廣泛的推廣，主要用于微生物中致病菌、益生菌的檢測，并制定出解決方案。PCR技術主要分為常規(guī)PCR、多重PCR、實時熒光定量PCR。下面主要對這3種PCR技術檢測副溶血性弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌進行了綜述。

2.1 常規(guī)PCR技術

常規(guī)PCR技術主要應用于環(huán)境、食品、臨床等不同來源樣品的快速檢測。

2.1.1

常規(guī)PCR技術檢測副溶血性弧菌。李志峰等檢測副溶血性弧菌的標準株和分離株，其靈敏度可達2.4×102 CFU/ml，并將擴增的tlh基因測序結果與GenBank中已收錄的tlh基因序列比較，兩序列的同源性達99%;結果表明該檢測方法快捷、特異性好、敏感性高[25]。王華麗等利用toxR基因檢測副溶血性弧菌并對PCR反應體系進行多次優(yōu)化[26];結果表明該檢測方法的靈敏度及檢測時間等指標均優(yōu)于鐘凱等[27]的報道。黃晨陽等基于toxR基因的環(huán)引物PCR法和已報道的PCR法對副溶血性弧菌和食品樣品進行檢測，并優(yōu)化反應條件[28];結果表明2種方法檢測副溶血性弧菌的特異度均為100%，檢出限分別為4×103 CFU/ml和5×104 CFU/ml。因此基于toxR基因的環(huán)引物PCR法檢測副溶血性弧菌的特異性更強，檢出限更低，檢測所需時間更短，能夠較好地滿足衛(wèi)生防疫機構快速檢測副溶血性弧菌的需要。何曉華等將人工構建擴增內標引入PCR檢測體系，從而檢測副溶血性弧菌[29];經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，該PCR反應體系的檢測靈敏度為1.16×102 CFU/ml。結果表明，該試驗方法能特異地檢測副溶血性弧菌，并可有效地排除假陰性，提高檢測準確率。

2.1.2

常規(guī)PCR技術檢測溶藻弧菌。韓一凡等根據(jù)溶藻弧菌toxR基因的高變區(qū)序列設計引物，進行特異性和敏感性試驗[30]。結果表明，該方法能特異地檢測出溶藻弧菌，每個PCR反應檢測的敏感度為0.01 pg的DNA 和3.7×103 CFU/ml的細菌，可用于對感染溶藻弧菌的水生動物疾病進行診斷。龐興紅等根據(jù)溶藻弧菌毒力菌株HN08155的1個新的特異性基因序列設計了1對特異性引物SDRHf和SDRHr ， 從而建立了與HN08155具有相似遺傳型的溶藻弧菌毒力菌株PCR快速分子檢測試劑盒[31]。結果表明，該方法具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，為海產(chǎn)品及水體中溶藻弧菌的檢測提供了一種有效方法。

2.1.3

常規(guī)PCR技術檢測創(chuàng)傷弧菌。

Kumar等建立了檢測海產(chǎn)品創(chuàng)傷弧菌gyrB基因的PCR程序，結果發(fā)現(xiàn)所有的創(chuàng)傷弧菌都出現(xiàn)一條285 bp的特異性條帶，其他細菌沒有特異擴增，發(fā)現(xiàn)該法的特異性強[32]。石琰璟等采用vvhA基因檢測創(chuàng)傷弧菌，靈敏度為3.6×102 CFU/ml比PCR-瓊脂糖凝膠電泳檢測方法高一個數(shù)量級[33]。結果表明，該方法具有較高靈敏度和良好特異性，操作簡單、檢測速度快。鄧曦等利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken中心組合試驗原理，設計一組3因素3水平試驗，通過響應曲面分析，得到優(yōu)化培養(yǎng)參數(shù)為：含鹽量3.65%，pH 6.75，培養(yǎng)溫度37 ℃，在該條件下培養(yǎng)液的OD595nm為0.520;然后用PCR對樣品進行快速檢測，發(fā)現(xiàn)該菌的檢出率高達23.3%;結果表明，該法能快速有效檢測水產(chǎn)品中存在的創(chuàng)傷弧菌[34]。

2.2 多重PCR技術

多重PCR是在普通PCR的基礎上發(fā)展起來的，指在同一PCR反應體系中同時加入多對擴增不同基因的引物，達到一次反應可以同時擴增多個基因的目的，這樣提高了檢測的通量，大大縮短了檢測的時間。

吳彩云等建立了一種雙重 PCR方法，運用該方法可同時檢測攜帶有tlh和tdh基因的副溶血性弧菌毒力菌株[35]。結果表明，該法不但具有常規(guī)PCR的優(yōu)點，而且還能節(jié)省耗材和時間，可用于檢測水產(chǎn)食品以及臨床樣品中的副溶血性弧菌的毒力菌株。Bej等根據(jù)副溶血性弧菌的tlh、tdh和trh基因設計引物，運用多重PCR檢測111份樣品中的副溶血性弧菌[36]，結果發(fā)現(xiàn)，該方法敏感性高、特異性強，而且能區(qū)分產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株，遠優(yōu)于傳統(tǒng)細菌學方法。

張新中等針對創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的gyrB基因的不同位點設計引物，從而對3種海產(chǎn)品進行了創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的檢測，結果在部分海產(chǎn)品中能特異性地檢測到目標菌株[37]。該方法快速、靈敏度高、特異性強，為海產(chǎn)品的創(chuàng)傷弧菌和副溶血性弧菌的檢測提供了有效的方法。劉陽等根據(jù)副溶血性弧菌和溶藻弧菌的toxR基因序列設計針對這2種細菌的2對特異性引物，建立能夠快速同時檢測這2種細菌的雙重PCR方法，并對該反應體系的特異性和靈敏度進行檢測[38]。結果顯示，純培養(yǎng)細菌VP和VA的檢測靈敏度分別為2.32×103 CFU/ml和2.56×103 CFU/ml，臨床病料檢測靈敏度分別為2 CFU和3 CFU;與其他菌無交叉反應;研究表明，該方法操作簡便、快速、特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好，并且經(jīng)濟實惠，值得推廣應用。魏霜等以細菌16S rRNA 基因為擴增內標靶序列，針對溶藻弧菌gyrB基因、副溶血性弧菌collagenase基因、創(chuàng)傷弧菌vvhA基因、霍亂弧菌ompW基因，分別設計特異性引物，建立多重 PCR 體系，對其靈敏度和特異性進行評價，并將建立的五重 PCR 應用于弧菌的篩選[39]。結果顯示，該方法能夠快速、靈敏、準確地檢測溶藻弧菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌4種食源性致病菌，靈敏度高，并能有效指示PCR反應的假陰性，適用于食品中常見致病性弧菌的快速篩檢。

2.3 熒光定量PCR技術

熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進程，通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA（ 或cDNA）的起始濃度進行定量，從而計算待測樣品的初始模板的方法[40]。

2.3.1

熒光定量PCR技術檢測副溶血性弧菌。

George等利用熒光定量PCR檢測牡蠣中副溶血性弧菌tdh陽性株，與傳統(tǒng)的PCR檢測方法比較，結果顯示該方法更快速、準確、靈敏度更高[41]。孫宏迪等根據(jù)副溶血性弧菌tdh基因設計合成引物及TaqMan探針，利用陽性質粒和模擬標本建立副溶血性弧菌的實時熒光定量PCR檢測方法[42]。結果表明，該方法的檢測靈敏度可達102 CFU/μl，并且特異性強，重復性好。LO等運用雙重PCR雜交探針建立的以toxR和tdh2為目標基因的熒光定量檢測體系[43]與Tyagi等建立的以SYBR為熒光染料的熒光定量PCR方法[44]相比，檢測效果更敏感快速。許龍巖等根據(jù)副溶血性弧菌的toxR基因和tdh基因，建立基于TaqMan探針雙重熒光PCR體系，進行副溶血性弧菌的特異性、敏感性試驗，其最低檢測濃度達到3.6×102 CFU/ml[45]。結果表明，該方法特異性好、靈敏度高，可用于食品中副溶血性弧菌的特異性及毒力基因檢測。

2.3.2

熒光定量PCR技術檢測溶藻弧菌。

目前利用熒光定量PCR技術檢測溶藻弧菌只有王海波等研究了，他們根據(jù)溶藻弧菌膠原酶基因colH的保守序列設計1對引物和1條TaqMan探針，優(yōu)化反應體系中的引物濃度和探針濃度，評價此反應體系的特異度[46]。結果發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的反應體系中較普通PCR提高了100倍，特異度為100%。結果表明，該法能夠靈敏和特異地檢測溶藻弧菌，可以作為溶藻弧菌的快速檢測方法。

2.3.3

熒光定量PCR技術檢測創(chuàng)傷弧菌。

Panicker等采用TaqMan實時PCR方法檢測vvhA基因的3對寡核苷酸引物和2個探針[47]，結果發(fā)現(xiàn)，81株創(chuàng)傷弧菌都出現(xiàn)陽性擴增結果，而25株非弧菌細菌和12株非目標弧菌的擴增結果都為陰性。結果表明，該方法具有快速、特異性強等特點。吳增輝等根據(jù)位于vvhA基因序列保守區(qū)設計引物和TaqMan探針，進行實時熒光定量PCR檢測，檢測靈敏度可達0.01 ng[48]。結果表明，該方法具有快速、穩(wěn)定、敏感、特異等優(yōu)點，適合用于臨床實驗室進行創(chuàng)傷弧菌引起的敗血癥和創(chuàng)口感染快速診斷。潘軍航等根據(jù)vvhA基因序列設計的引物和探針進行實時熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)建立的實時熒光定量PCR特異性強，僅對創(chuàng)傷弧菌呈陽性結果，對預增菌5 h后經(jīng)QIAamp DNA miniKit提取的DNA進行實時熒光定量PCR檢測，其檢測效果最佳，靈敏度達1.4 CFU/ml[49]。結果表明，該方法具有快速、特異性強、敏感高等特點，且能在8 h內完成在牡蠣等海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的快速檢測。

3 總結與展望

通過上述研究可以發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術的靈敏度比較高，但是成本比較高，對于基層單位使用負擔比較大，與其他2種技術相比其省去了凝膠電泳的繁瑣操作，避免了試驗過程中污染，既減少了假陽性的發(fā)生率，又縮短了檢測時間，近年來已被廣泛應用于臨床、食品等樣品中致病菌的檢測;而常規(guī)PCR技術雖然成本低，但是它不能定量，靈敏性相對較低;多重PCR技術的體系比較復雜，需要花費更多的時間去摸索穩(wěn)定的體系，以及要避免引物之間形成二聚體，干擾試驗結果，但它消耗的時間和試劑比較少，而且還可減少或避免因操作步驟過多而污染所帶來的假陽性等問題。

隨著研究的深入，人們可以加強溶藻弧菌對哺乳動物特別是人類的致病機理的研究，對創(chuàng)傷弧菌的研究也需進一步的推進，對弧菌假陰性的研究以及各種弧菌間是否有交叉污染也要進一步的深入研究。相信隨著分子生物學的發(fā)展，新的技術、儀器不斷的出現(xiàn)，PCR會不斷完善，特別是與各種分子技術的融合和創(chuàng)新，這將會促使水產(chǎn)品中的弧菌快速、準確、靈敏、特異、大規(guī)模檢測的實現(xiàn)。

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