CRISPR結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理研究進(jìn)展

謝曉蕾，李求春(揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009)

在生物進(jìn)化歷史中，細(xì)菌一直受到諸多外源因素的侵?jǐn)_，噬菌體是其中具有極大威脅的一種，因而細(xì)菌在生存壓力下進(jìn)化出了多種抵抗噬菌體干擾的機(jī)制，如DNA注入抑制、吸附抑制、無(wú)效感染等［1］。在細(xì)菌體內(nèi)，基因干擾途徑可以通過(guò)基因序列保證自身基因的正常表達(dá)，同時(shí)維持基因組的完整性。該途徑的重要性表現(xiàn)在真核生物中即為RNA干擾，另外在很多細(xì)菌和古生菌中也存在類似的干擾途徑［2］。短回文重復(fù)序列CRISPR及其相關(guān)Cas(CRISPR associated)基因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)菌以及古細(xì)菌提供了一套新的免疫防御系統(tǒng)，以抵御外界遺傳物質(zhì)的入侵，從而維持自身遺傳信息的完整性。任何免疫系統(tǒng)的基本要求之一就是能夠產(chǎn)生免疫記憶，從而能有效地應(yīng)對(duì)再次感染。CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的特征在于它能記錄入侵的外源DNA序列，并以間隔序列的形式將其整合到自身的DNA序列中，從而產(chǎn)生免疫記憶。間隔序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄后形成一段短的反義RNA，可與再次入侵的外源DNA序列互補(bǔ)配對(duì)，并在Cas蛋白的作用下，使其降解［3］，從而抑制外源DNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯，使噬菌體無(wú)法在細(xì)菌體內(nèi)生存和繁殖。

1 CRISPR研究歷史

1987年，日本大阪大學(xué)課題組在研究E.coli K12的堿性磷酸酶時(shí)，在該酶的編碼基因附近觀察到一段串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后研究中發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古生菌的基因組中［1，4］。MOJICA 等［5］于 2000年提出把CRISPR作為重復(fù)序列家族的一類成員，并將其命名為Short Regularly Spaced Repeats(SRSRs)。直到2002年，JANSEN等［6］才將其正式命名為 clustered regularly interspaced short palindromic repects(CRISPR)，以更準(zhǔn)確的描述這一重復(fù)序列的獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征。隨著CRISPR的發(fā)現(xiàn)，CRISPR的功能逐漸被揭示。2005年，3個(gè)研究小組均發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列與宿主菌染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)其可能作為細(xì)菌的免疫系統(tǒng)以抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵［7－11］。BARRANGOU等［12］首次在嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)中發(fā)現(xiàn)并通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)，細(xì)菌能通過(guò)CRISPR系統(tǒng)抵抗噬菌體的入侵。隨后MARRAFFINI等［13］也發(fā)現(xiàn)在葡萄球菌中CRISPR系統(tǒng)能夠阻止外源基因的水平轉(zhuǎn)移，同時(shí)防止耐藥性的產(chǎn)生，從此揭開(kāi)了CRISPR系統(tǒng)作用機(jī)制研究的序幕。2013年，CRISPR介導(dǎo)的基因定位編輯技術(shù)出現(xiàn)，研究人員利用這一系統(tǒng)對(duì)人類細(xì)胞、小鼠、大鼠、斑馬魚、細(xì)菌、果蠅、農(nóng)作物等多種生物的基因進(jìn)行定向缺失、插入、激活或抑制等遺傳改造操作，從而證明了CRISPR技術(shù)的廣泛應(yīng)用價(jià)值。

2 CRISPR分布與分類

最近更新的CRISPR數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，在已完成全基因組測(cè)序的90%古生菌和約40%細(xì)菌中均可鑒定出至少一個(gè)CRISPR位點(diǎn)。不同菌株中的CRISPR位點(diǎn)數(shù)量不同，一個(gè)原核細(xì)胞基因組中通常存在1至幾個(gè)CRISPR位點(diǎn)［7］。其中詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的染色體上存在18個(gè)CRISPR位點(diǎn)，在目前已研究的原核生物中排第一位［14］。CRISPR位點(diǎn)大多定位在染色體上，只有個(gè)別出現(xiàn)在質(zhì)粒中［15］。

根據(jù)Cas基因核心原件序列的不同，CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)可分為3種類型，每一種類型具有很多亞型。目前應(yīng)用最廣泛的是II型，也是3種類型中最為簡(jiǎn)單的一類。I型系統(tǒng)最為復(fù)雜，需要6個(gè)Cas蛋白參與，其中Cas3蛋白對(duì)CRISPR功能的發(fā)揮至關(guān)重要，該蛋白具有解旋酶活性及DNA酶活性，是干擾階段的主要作用酶［16］。Ⅱ型系統(tǒng)的組成相對(duì)較簡(jiǎn)單，以Cas9蛋白為核心。干擾階段，RNAseⅢ在Cas9蛋白存在的情況下發(fā)揮作用，Cas9蛋白協(xié)助crRNA(CRISPR RNA)的成熟，并參與外源DNA的剪切［17］。在Ⅲ型系統(tǒng)中，Cas6主要參與crRNA的成熟，加工過(guò)后的crRNA被運(yùn)送至特殊的Cas剪切復(fù)合體中發(fā)揮導(dǎo)向作用［18］。

3 CRISPR結(jié)構(gòu)

CRISPR主體為CRISPR基因座(CRISPR locus)，基因座上游含有一段前導(dǎo)序列(leader sequence，LS)以及與CRISPR功能相關(guān)的基因(CRISPR-associated genes，Cas genes)，三者共同構(gòu)成了CRISPR系統(tǒng)。

3.1 CRISPR基因座 CRISPR基因座由簡(jiǎn)短穩(wěn)定的同向重復(fù)序列(direct repect，DR)和長(zhǎng)度相近的非重復(fù)的間隔序列(spacer)間隔排列而成，稱為R-S結(jié)構(gòu)。其中重復(fù)序列的片段長(zhǎng)度在21～48 bp［19］，且含有5～7 bp的回文序列，通常能形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，間隔序列的長(zhǎng)度在26～72 bp，可能來(lái)源于噬菌體、質(zhì)粒等外源DNA序列。

3.2 cas基因 cas基因是存在于CRISPR位點(diǎn)附近的一系列基因，cas基因簇通常由4～10個(gè)保守基因組成［20］，它表達(dá)出的cas蛋白對(duì)CRISPR防御機(jī)制的實(shí)現(xiàn)不可或缺。cas基因根據(jù)其保守程度可分為核心cas基因、亞型特異性cas基因和重復(fù)序列相關(guān)未知蛋白(repeat-associatedmysteriousproteins，RAMP)組件基因［21］。cas1～6基因廣泛存在于各種CRISPR亞型中，故被稱為核心cas基因，其編碼蛋白的功能現(xiàn)已初步得到證實(shí)，例如，Cas1和Cas2蛋白在所有CRISPR類型中均存在，主要在獲取新的重復(fù)序列過(guò)程中發(fā)揮作用［22］，Cas3則具有核酸酶和解旋酶的功能，主要作用是剪切目標(biāo)基因［23］。

3.3 Leader序列 前導(dǎo)序列由300～500 bp堿基組成，位于CRISPR的5'端，與第一個(gè)重復(fù)序列直接相連，是一段在物種內(nèi)相對(duì)保守的AT富集的區(qū)域［24］。研究發(fā)現(xiàn)，新的R-S總是插入前導(dǎo)序列和第一個(gè)重復(fù)序列之間，表明前導(dǎo)序列是新插入序列的識(shí)別位點(diǎn)，也有研究指出，它能夠作為啟動(dòng)子，啟動(dòng)CRISPR基因座的轉(zhuǎn)錄［7］。

4 CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機(jī)理

CRISPR/Cas是一種防御系統(tǒng)，用以保護(hù)細(xì)菌和古細(xì)菌不受外來(lái)物質(zhì)的侵害。這些生物基因組中的CRISPR位點(diǎn)能表達(dá)出與入侵病毒基因組序列匹配的crRNA，當(dāng)微生物再次感染這種病毒時(shí)，crRNA能通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)與病毒基因組結(jié)合，并表達(dá)出相關(guān)的Cas酶，這些酶能夠切割病毒DNA，從而阻止病毒的基因表達(dá)。研究證明，CRISPR作用機(jī)制可大致分為3個(gè)階段:適應(yīng)階段、表達(dá)階段和干擾階段［25］。

適應(yīng)階段:在外源物質(zhì)入侵宿主菌后，外來(lái)噬菌體或質(zhì)粒上的一小段DNA序列(前間區(qū)序列，protospacers)會(huì)以非同源重組的方式被整合到宿主菌的基因組中，整合的位置位于前導(dǎo)序列與第一個(gè)重復(fù)序列之間［12］，且每插入一段外源序列都會(huì)伴隨著一次重復(fù)序列的復(fù)制，從而形成新的R-S結(jié)構(gòu)。這一過(guò)程使得宿主CRISPR含有外源序列信息，為干擾階段發(fā)揮作用提供基礎(chǔ)。宿主對(duì)外源DNA序列的選擇也并非隨機(jī)的，研究發(fā)現(xiàn)，在前間區(qū)序列附近含有一些特定序列稱為前間區(qū)序列鄰近序列(protospacer adjacent motifs，PAMs)，如嗜熱鏈球菌的 NNAGAAW 序列［26］，不同 CRISPR亞型對(duì)于PAM的識(shí)別具有特異性。目前，對(duì)于CRISPR攝取外源基因的作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

表達(dá)階段:CRISPR基因座首先被轉(zhuǎn)錄成一段長(zhǎng)鏈的RNA，稱為CRISPR RNA前體(Pre-crRNA)，同時(shí)，Cas蛋白將形成一個(gè)具有內(nèi)切酶功能的復(fù)合物，特異性地將crRNA切割加工成小的成熟crRNA。成熟的crRNA會(huì)與Cas蛋白復(fù)合物結(jié)合形成具有特殊功能的Cas/crRNA作用復(fù)合體，在干擾階段發(fā)揮作用。

干擾階段:當(dāng)宿主再次接觸到外界噬菌體或質(zhì)粒時(shí)，crRNA便會(huì)與其同源的外源核酸特異性結(jié)合，而后通過(guò)Cas/crRNA作用復(fù)合體將外源核酸切割成碎片，使其無(wú)法行使功能，從而達(dá)到保護(hù)宿主基因組的目的。

5 CRISPR的應(yīng)用

5.1 基因定點(diǎn)改造 近年來(lái)，RNA干擾(RNAi)、鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)已應(yīng)用于多種類型的細(xì)胞和生物模型的基因改造，而CRISPR/Cas作為一種全新的基因定點(diǎn)改造技術(shù)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

RNAi是一種相對(duì)快速、廉價(jià)、高通量的基于全基因組的基因定向敲除技術(shù)。然而，該技術(shù)的敲除效果仍不夠理想，不同批次試驗(yàn)以及不同實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有所差異，同時(shí)也存在不可預(yù)知的脫靶情況，所以該方法目前僅用于需要暫時(shí)抑制基因發(fā)揮功能的試驗(yàn)中，因此局限性大，實(shí)用性不強(qiáng)。

ZFNs，又名鋅指蛋白核酸酶，是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，由一個(gè)DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成。該技術(shù)能夠?qū)Π谢蜻M(jìn)行定點(diǎn)切割和基因敲除，可顯著提高同源重組率，是一種高效成熟的基因改造技術(shù)。然而ZNFs雖然具有較高的特異性和精確性，但也會(huì)發(fā)生極低概率的脫靶事件［27］。

TALENs是一種嶄新的分子生物學(xué)工具。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自植物細(xì)菌黃單孢桿菌(Xanthomonas sp.)TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因而利用TAL的序列模塊，即可組裝成特異的蛋白結(jié)構(gòu)域以結(jié)合任意DNA序列，從而達(dá)到定向改造內(nèi)源基因的目的。目前，TALEN的研究尚處于起步階段，其優(yōu)點(diǎn)很明顯，但在識(shí)別的特異性方面和免疫性方面也存在一定的局限性。

ZFNs和TALENs都是利用蛋白質(zhì)來(lái)定位靶序列，這些蛋白質(zhì)通常很難生成而且成本昂貴。而CRISPRs利用的是RNA，使得設(shè)計(jì)它們變得較為容易，因而具有很好的應(yīng)用前景。

2013年1月份美國(guó)2家實(shí)驗(yàn)室在《Science》雜志發(fā)表了基于CRISPR-Cas技術(shù)在細(xì)胞系中進(jìn)行基因敲除的新方法，該技術(shù)與以往的技術(shù)不同，是利用位點(diǎn)特異性的crRNA將Cas9核酸酶帶到基因組上的具體靶位點(diǎn)，從而對(duì)特定基因位點(diǎn)進(jìn)行切割。該技術(shù)又迅速被運(yùn)用到基因敲除小鼠和大鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建中，這意味著一種全新的基因定點(diǎn)改造系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)已經(jīng)出現(xiàn)，其特點(diǎn)是制作簡(jiǎn)單，成本低，作用高效。

5.2 分子分型 對(duì)于同一個(gè)物種，CRISPR位點(diǎn)的重復(fù)序列絕大多數(shù)非常保守［28－29］;而間隔序列則具有很強(qiáng)的多態(tài)性，即使在同一物種的不同菌株間，間隔序列也往往不同，該性質(zhì)使得CRISPR位點(diǎn)可以作為細(xì)菌分子分型的一個(gè)高分辨率的標(biāo)準(zhǔn)［8－9］。SCHOULS 等［30］采用 CRISPR 分型方法對(duì)184株空腸彎曲菌進(jìn)行了分型，分型結(jié)果與AFLP、MLST一致性較高。此外，法國(guó)研究者對(duì)來(lái)源于130個(gè)血清型的783株沙門菌的CRISPR進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，CRISPR序列的多態(tài)性與血清型和多位點(diǎn)序列型有著密切的聯(lián)系，說(shuō)明CRISPR對(duì)于沙門菌具有較高的分辨率，可用于分型研究。同時(shí)還建立了間隔序列數(shù)據(jù)庫(kù)，為沙門菌分型和基因分型提供數(shù)據(jù)支持，也為菌株溯源追蹤提供信息［31］。CRISPR分型方法與傳統(tǒng)的分型方法相比，操作簡(jiǎn)便，對(duì)于基因多態(tài)性較低的細(xì)菌分辨率較高，而對(duì)于基因多態(tài)性較高的細(xì)菌可將CRISPR與其他分型方法相結(jié)合。Liu等將MLST與CRISPR 2種方法相結(jié)合建立了一種新的CRISPR-MVLST分型方法，通過(guò)對(duì)沙門菌的2個(gè)毒力基因SseL、FimH和CRISPR序列的研究，對(duì)來(lái)源于9個(gè)血清型的171株沙門菌進(jìn)行了分型，CRISPR序列的加入顯著提高了個(gè)別疾病爆發(fā)菌株的區(qū)分能力，另外，該分型方法對(duì)腸炎沙門菌的區(qū)分能力要高于PFGE［32］。這表明CRISPR可以作為一種新的分型方法，并具有廣闊的運(yùn)用前景，另外CRISPR中的間隔序列提供了細(xì)菌所處的外界環(huán)境信息，也可以為細(xì)菌的溯源追蹤提供信息。

6 結(jié)語(yǔ)

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為原核細(xì)胞的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，不僅具有特異性和記憶性，還具有可遺傳性。CRISPR的間隔序列高度可變、迅速進(jìn)化［32－33］，新間隔序列的獲得需要很多因素的作用及相關(guān)蛋白的輔助。間隔序列的獲得使得細(xì)菌能夠很快適應(yīng)外界環(huán)境，也有研究指出，在宿主CRISPR位點(diǎn)中重復(fù)序列與間隔序列構(gòu)成的結(jié)構(gòu)有時(shí)也會(huì)被刪除［9，20，26，33］，被刪除的部分大多是位于 CRISPR 3'端較為保守的間隔序列。這些間隔序列的刪除可能是因?yàn)镃RISPR的重復(fù)序列間發(fā)生了同源重組所導(dǎo)致的［34］，對(duì)CRISPR位點(diǎn)的大小和轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度的控制具有重要的作用。CRISPR在參與原核細(xì)胞的獲得性免疫的同時(shí)，在細(xì)菌和噬菌體兩者的共同進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。事實(shí)上，在前間區(qū)序列中或前間區(qū)序列鄰近序列中，單一核苷酸的改變能使噬菌體逃避CRISPR免疫機(jī)制［33］。盡管目前對(duì)CRISPR作用機(jī)制具有大致的了解，但現(xiàn)階段還存在許多問(wèn)題有待更深入的研究和探索。

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