桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)D-半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用*

河南省平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院 李 莉 張喜德 張恩戶(平頂山467000)

桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊由獐牙菜、兔耳草、波棱瓜子、小檗皮、靈芝、藏木香等組成，具有清熱解毒，疏肝健脾，活血化瘀等功效，主要用于治療急、慢性肝炎。本研究采用D-半乳糖胺 (D-GlaN)致小鼠急性肝損傷模型，通過測(cè)定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (AST)水平，肝組織勻漿超氧化物歧化酶 (SOD)活力、脂質(zhì)過氧化物丙二醛 (MDA)含量等指標(biāo)，并觀察小鼠肝組織病理變化，評(píng)價(jià)桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊的保肝作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量 (20±2)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK2002-005.046。

1.2 藥物和試劑 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊清膏，1 mL含生藥2.2 g;D-GlaN(Sigma公司，臨用前取1.68 g，用生理鹽水溶解，再用1 mol/mL的NaOH溶液調(diào)節(jié)至7.0，然后再加生理鹽水15 mL配置成10%濃度);聯(lián)苯雙酯滴丸 (浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號(hào):060705);乙肝解毒膠囊 (武漢健民集團(tuán)隨州藥業(yè)有限公司，批號(hào):060203);SOD、MDA試劑盒 (南京建成生物研究所，批號(hào):20060810)。

1.3 主要儀器設(shè)備 低速離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠;Nikon DXMF1200顯微鏡 (Nikon公司);7600-020型全自動(dòng)生化分析儀 (日立公司)。

2 方法［1－2］

昆明種小鼠98只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，分別秤重標(biāo)記，隨機(jī)分組為:空白對(duì)照組、模型組、桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊高、中、低劑量組、聯(lián)苯雙酯組、乙肝解毒膠囊組，每組14只。桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊高、中、低劑量組分別按照14.28、7.14、3.57 g/kg劑量灌胃;乙肝解毒膠囊組按內(nèi)容物0.9 g/kg劑量灌胃給藥;聯(lián)苯雙酯組以200 mg/kg劑量灌胃給藥;空白組和模型組以純凈水灌胃。每天給藥1次，連續(xù)5天，給藥容積為20 mL/kg。第5天灌胃給藥后1 h，按D-GlaN劑量1 g/kg給小鼠腹腔注射1次造模，小鼠禁食不禁水。24 h后，全部小鼠摘眼球取全血，以2 000 r/min速度離心10 min分離得血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清ALT、AST水平。取肝臟，在肝左葉同一部位剪取一小塊肝組織放置10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病變程度 (病變程度分別以“+++”、“++”、“+”、“-”表示，“+++”表示重度肝細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞片狀壞死，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn);“++”表示中度肝細(xì)胞水腫，肝細(xì)胞灶狀壞死，或明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn); “+”表示輕度肝細(xì)胞水腫，散在肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，少許炎細(xì)胞浸潤(rùn);“-”表示肝組織無水腫，無壞死，無炎細(xì)胞浸潤(rùn))。剩余肝臟用4℃生理鹽水漂洗后放置于-80℃冰箱，測(cè)試前取肝臟，稱量，加生理鹽水，肝臟重量和生理鹽水體積按1︰9的比例，在冰浴中制備10%肝組織勻漿，4℃3 000 r/min離心15 min，取上清液。按試劑盒操作說明測(cè)定上清液中SOD、MDA含量。

3 結(jié)果

3.1 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)D-GlaN致急性肝損傷小鼠血清 ALT、AST的影響 模型組小鼠血清中ALT、AST升高明顯，與空白對(duì)照組比較差異有非常顯著性 (P＜0.01)，說明造模成功。桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊各劑量組ALT水平明顯降低，與模型組比較，差異有顯著性;桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊高、中劑量組和聯(lián)苯雙酯組AST水平與模型組相比，差異有顯著性(P ＜0.01或P ＜0.05)。詳見表1。

3.2 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)D-GlaN致急性肝損傷小鼠肝組織勻漿MDA、SOD的影響 與模型對(duì)照組比較，桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊高、中劑量組肝組織中SOD活性明顯高于模型組，MDA含量明顯低于模型組，差異有顯著性(P＜0.01或P＜0.05)。詳見表1。

表1 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA、SOD的影響(±s)

表1 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)血清ALT、AST及肝組織勻漿MDA、SOD的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù) (只)劑量 (g/kg) ALT(U/L) AST(U/L) MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)空白對(duì)照組 12 - 59.4±23.8＊＊ 116.4±65.4＊＊ 1.6±0.3＊＊ 132.7±9.7＊＊＊＊模型對(duì)照組 12 - 222.4±40.0 317.5±124.8 3.8±0.6 111.0±10.7聯(lián)苯雙酯組 11 0.20 127.1±36.7＊＊ 246.3±58.4* 2.4±0.6＊＊ 127.6±17.7*乙肝解毒組 12 0.90 171.0±32.9* 262.4±96.1 2.7±0.5* 124.6±18.1*低劑量組 11 3.57 170.2±38.7* 263.4±80.7 2.8±0.7 123.5±10.8中劑量組 10 7.14 154.7±39.3＊＊ 225.1±84.9* 2.6±0.5* 127.3±9.2*高劑量組 10 14.28 124.2±26.8＊＊ 204.9±69.2＊＊ 2.1±0.5＊＊ 130.5±12.9

3.3 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)D-GlaN致急性肝損傷小鼠肝臟組織病理學(xué)改變的影響 與模型對(duì)照組比較，桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊高、中劑量組肝組織損傷積分較低，說明高、中劑量組的保肝作用較好，而低劑量組及乙肝解毒膠囊組肝組織損傷積分較高。說明桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊可減輕D-GlaN肝損傷動(dòng)物肝細(xì)胞變性、壞死，有一定程度對(duì)抗D-GlaN所致肝細(xì)胞病理損害作用。詳見表2。

表2 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)肝臟組織病理學(xué)改變的影響(±s)

表2 桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)肝臟組織病理學(xué)改變的影響(±s)

組別 動(dòng)物數(shù)(只)肝細(xì)胞水腫 肝細(xì)胞壞死- + ++ +++ P值炎細(xì)胞浸潤(rùn)- + ++ +++- + ++ +++＜0.05模型對(duì)照組 14 7 2 3 2 8 3 2 1 7 3 2 2聯(lián)苯雙酯組 14 10 2 1 1 12 1 1 0 11 1 1 1 P＜0.05乙肝解毒組 14 9 2 2 1 10 1 1 2 10 2 1 1低劑量組 14 7 4 2 1 8 3 1 2 8 2 2 2中劑量組 14 10 2 1 1 10 2 2 0 11 2 1 0 P＜0.05高劑量組 14 11 1 1 1 12 1 1 0 12 1 1 0 P＜0.05空白對(duì)照組 14 9 3 2 0 14 0 0 0 14 0 0 0 P

4 討論

D-GlaN復(fù)制的肝損傷可模擬病毒性肝損傷，其表現(xiàn)出來的癥狀，肝功能檢測(cè)指標(biāo)，肝臟病理改變與病毒性肝炎具有相似性，是目前公認(rèn)的比較好的研究病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制及有效治療藥物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。［3］D-GlaN是肝細(xì)胞的磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，進(jìn)入體內(nèi)后與磷酸尿苷結(jié)合形成磷酸尿苷-半乳糖胺，致使磷酸尿苷耗竭，導(dǎo)致核酸、糖、蛋白、脂類等物質(zhì)合成受抑致，限制了細(xì)胞器及酶的生成和補(bǔ)充，細(xì)胞器受損、膜損害，鈣離子內(nèi)流入細(xì)胞，從而造成肝細(xì)胞損傷，肌體對(duì)內(nèi)毒素吸收增加、自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等也是D-GlaN致肝損傷的重要因素。［4］肝細(xì)胞內(nèi)所含的酶是血清酶類的主要來源，整個(gè)肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶的量約為血清中的100倍，ALT主要存在于肝細(xì)胞的可溶部分，AST則存在于肝細(xì)胞的線粒體中，故血清中ALT和AST水平可敏感反映肝細(xì)胞膜的損傷狀況。［5］MDA為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可以破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，SOD是清除氧自由基的重要酶，具有清除超氧陰離子自由基，防止自由基對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，二者聯(lián)合檢測(cè)可以反應(yīng)肌體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。本文結(jié)果表明，桑蒂?gòu)?fù)肝膠囊對(duì)D-GlaN所致小鼠急性肝損傷有明顯的保護(hù)作用，可以降低小鼠血清AST、ALT水平，提高肝組織勻漿SOD活力，降低MDA含量，減輕小鼠肝損傷組織的病理程度，其機(jī)制可能與其保肝降酶、清除自由基等有關(guān)。

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［3］陳奇.中藥藥理研究方法學(xué) ［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1993.980

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