血糖水平對(duì)缺血再灌注腦組織過(guò)氧化損傷的影響

任 歆 黃 蕊 成學(xué)恭 李光來(lái)

煤炭總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100028

腦血管疾病是神經(jīng)系統(tǒng)的常見(jiàn)病，包括腦出血及腦梗死，是致殘率及致死率非常高的疾病，每年可造成數(shù)十億的人群死亡或喪失勞動(dòng)能力，給社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。根據(jù)病變血管的不同，可以導(dǎo)致局灶性或彌漫性腦功能缺失，在臨床上可以導(dǎo)致患者肢體癱瘓、感覺(jué)缺失、言語(yǔ)功能障礙等，給患者的日常生活造成巨大困擾，缺血性腦卒中約占腦卒中的80%，包括腦栓塞、腦血栓形成及腔隙性腦梗死等。早期進(jìn)行溶栓治療可以盡可能地恢復(fù)阻塞血管的血流，恢復(fù)梗死區(qū)的血供，以期恢復(fù)或改善梗死區(qū)的腦功能，但伴隨出現(xiàn)卻是明顯的再灌注損傷問(wèn)題，后者不僅沒(méi)有恢復(fù)腦卒中造成的神經(jīng)功能缺失，反而導(dǎo)致病灶局部出現(xiàn)一系列繼發(fā)性改變，導(dǎo)致腦水腫及神經(jīng)功能損傷加重[1-2]。大量研究證實(shí)，再灌注損傷的機(jī)制包括：阻塞血管無(wú)復(fù)通、微循環(huán)障礙、能量匱乏、自由基大量生成、鈣超載及誘發(fā)一系列有害基因表達(dá)等。研究表明，腦缺血急性期可以導(dǎo)致機(jī)體應(yīng)激性血糖升高，血糖水平的異?？梢约又啬X組織損傷。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同血糖水平下，缺血再灌注損傷后腦細(xì)胞結(jié)構(gòu)、ATP酶的活力及細(xì)胞氧化還原能力的變化，對(duì)動(dòng)物模型溶栓過(guò)程中血糖水平進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制作及分組

取24只健康雄性Wistar大鼠 （2～3月齡，230～260 g），采用急性腦缺血再灌注模型[4-5]，按照360 mg/kg腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，動(dòng)物取仰臥位，雙側(cè)逐層分離出頸總動(dòng)脈，以小動(dòng)脈夾夾閉造成腦缺血，30 min以后松開(kāi)動(dòng)脈夾再灌注2 h，取靜脈血并斷頭處死，1 min內(nèi)分離出額、顳、頂部大腦皮質(zhì)，左側(cè)用做病理及電鏡檢查，右側(cè)置-70℃冰箱保存待測(cè)。

1.2 儀器與設(shè)備

普通胰島素與中性魚(yú)精蛋白鋅胰島素（中國(guó)徐州萬(wàn)邦生化制藥有限公司，江蘇）、四乙氧基丙烷（TEP）、硫代巴比妥酸（TBA）等為國(guó)產(chǎn)分析純，黃嘌呤氧化酶、黃嘌呤（美國(guó)Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）標(biāo)準(zhǔn)品（德國(guó)BOEHRINGER MANNHEIM公司），ATP測(cè)試盒與SOD測(cè)試盒（南京建成生物制品研究所），722光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠），透射電鏡（JEOL-100 型），光鏡（OLYMPUS-VANOX 型）。

1.3 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分成4組，每組6只，分別為假手術(shù)組（A組），分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈并備線即結(jié)束，作為對(duì)照；生理鹽水對(duì)照組（B組）；胰島素（2.1 U/kg）組（C 組）；胰島素（2.1 U/kg）+50%葡萄糖（2 g/kg）組（D組）。參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[3，6]，在夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈造成腦缺血后，B組給予生理鹽水4 mL/kg經(jīng)腹腔內(nèi)注射；C組給予胰島素2.1 U/kg（普通胰島素RI與中性魚(yú)精蛋白鋅胰島素NPH以1∶2的比例分別進(jìn)行腹腔內(nèi)注射和皮下注射）；D組給予給予胰島素2.1 U/kg（同C組），同時(shí)給予50%葡萄糖注射液2 g/kg腹腔注射。各組于術(shù)前0.5 h、術(shù)后0.5、1.5、2.5 h取尾血用微量血糖儀（ADVANTAGE，U.S.A）檢測(cè)血糖。對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物以100 W照明燈照射，以保持動(dòng)物肛溫在36.5～37.5℃之間。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 腦組織丙二醛（MDA）測(cè)定 采用改良八木國(guó)夫法[7]。將腦組織制成1%勻漿，取0.3 mL于10 mL小試管中，加入0.7 mL蒸餾水，于漩渦器上混合30 s，加入0.5 mL TBA溶液，用玻璃棒攪拌使液體均勻，放入95℃左右的甘油浴中攪拌，加熱60 min后取出，放冷水中冷卻，加入2.5 mL正丁醇于漩渦器上提取30 s，再以3000 r/min離心10 min。吸取上清液于1 cm比色皿中，在分光光度計(jì)上于535 cm波長(zhǎng)處，測(cè)定吸光度值。以正丁醇為參比。同時(shí)以四乙氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 nmol/mL）1 mL于10 mL小試管中，加入0.5 mL TBA溶液做標(biāo)準(zhǔn)，操作同上。

1.4.2 腦組織SOD測(cè)定 采用黃嘌呤氧化酶法。根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行，取腦組織上清液在分光光度計(jì)波長(zhǎng)550 nm處比色，讀取OD值。按照每毫克腦組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽單位（NU）。

1.4.3 腦組織ATP酶活性檢測(cè) 在體內(nèi)ATP酶可以將ATP分解生成ADP和無(wú)機(jī)磷，因此無(wú)機(jī)磷的含量可間接反映ATP酶活力的狀態(tài)。根據(jù)試劑盒提供的步驟進(jìn)行，在分光光度計(jì)波長(zhǎng)660 nm處比色，讀取OD值。以每小時(shí)每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無(wú)機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位，即微克分子磷/（mg prot·h）。

1.5 腦組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

試驗(yàn)動(dòng)物處死后在1 min內(nèi)快速取出一側(cè)大腦半球，固定于中性福爾馬林液中，常規(guī)脫水、包埋后，切成0.3 mm的組織切片，以伊紅、蘇木精染色，置于OLYMPUS-VANOX型光鏡下，觀察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

每組試驗(yàn)動(dòng)物中隨機(jī)抽取2只，處死后快速取額、頂葉大腦組織，投入2.5%的戊二醛溶液中固定，30 min后取出，快速切割為1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，重新投入固定液，按電鏡標(biāo)本常規(guī)脫水、包埋后做超薄切片，切片在JEOL-100型透射電鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物血糖水平比較

按照上述試驗(yàn)方法，A組為假手術(shù)組，血糖水平在正常范圍內(nèi)，B組血糖水平由于機(jī)體應(yīng)激明顯升高，缺血再灌注1.5 h后升高更為明顯（P＜0.01），給予胰島素干預(yù)后 （C組）血糖水平明顯降低 （P＜0.01），與C組等量的胰島素干預(yù)并同時(shí)給予適當(dāng)葡萄糖補(bǔ)充（D組），可將血糖水平控制在正常范圍的高限。見(jiàn)表1。

2.2 各組動(dòng)物缺血再灌注后氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)的比較

大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)MDA、SOD含量變化研究結(jié)果表明，缺血再灌注損傷發(fā)生后，每100毫克腦組織蛋白內(nèi)的MDA含量明顯升高，SOD含量明顯下降，在B組及C組更為明顯（P＜0.01），而且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；采用與C組等量胰島素加葡萄糖干預(yù)（D組）將缺血再灌注后血糖水平調(diào)節(jié)至正常值高限，其MDA含量及SOD含量同B組及C組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示血糖值在正常范圍高限可以減輕氧化應(yīng)激損傷。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠血糖水平比較（mmol/L，±s）

注：與A組相比，#P＜0.01

組別 只數(shù) 缺血前0.5 h 缺血后0.5 h 缺血后1.5 h 缺血后2.5 h A組B組C組D組6 6 6 6 3.94±0.38 3.87±0.64 3.90±0.52 3.85±0.34 6.26±0.51 4.79±0.02 3.33±0.21#4.83±0.35 6.67±0.30 8.05±0.31#3.13±0.22#5.16±0.33 6.58±0.30 10.07±0.25#3.11±0.24#6.98±0.21

表2 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)MDA、SOD含量（±s）

表2 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)MDA、SOD含量（±s）

注：與 A組比較，#P＜0.01；與 D組比較，*P＜0.01；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

組別 只數(shù) MDA（μmol/100 mg prot） SOD（NU/100 mg prot）A組B組C組D組6 6 6 6 40.42±4.91 59.33±5.59#*52.38±6.69#*44.13±4.27 188.67±20.93 126.12±20.43#*141.53±16.97#*170.80±14.23

2.3 各組動(dòng)物缺血再灌注后腦組織內(nèi)ATP酶活性的比較

在急性缺血再灌注損傷發(fā)生后，應(yīng)激性血糖升高（B組）以及胰島素干預(yù)使血糖過(guò)度降低（C組）都可以導(dǎo)致腦組織內(nèi)氧化應(yīng)激加重，導(dǎo)致ATP酶活性的下降（P＜0.01），但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而將血糖控制在正常值高限（D組）可以明顯升高ATP酶的活性，減輕氧化應(yīng)激損傷（P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)的ATP酶活性比較[微克分子磷/（mg prot·h），±s]

表3 各組大鼠急性腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)的ATP酶活性比較[微克分子磷/（mg prot·h），±s]

注：與A組比較，#P＜0.01；與D組比較，*P＜0.01

組別 只數(shù) Na+-K+-ATPaseMg2+-ATPase Ca2+-ATPase Ca2+-Mg2+-ATPase A組B組C組D組6 6 6 6 33.45±6.08 18.97±2.43#*21.75±2.90#*31.95±3.41 71.58±5.29 41.50±3.63#*44.02±6.57#*66.80±4.98 34.75±5.02 22.95±3.22#*25.87±4.24#*34.13±3.26 34.42±2.94 23.17±3.49#*24.30±4.85#*35.33±4.94

2.4 腦組織鏡下組織學(xué)改變

光學(xué)顯微鏡下腦組織切片：A組大腦皮質(zhì)細(xì)胞分層清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；腦缺血30 min，再灌注2 h后，B組與C組皮質(zhì)細(xì)胞層次結(jié)構(gòu)消失，排列紊亂，細(xì)胞水腫，胞核皺縮、深染，大部分錐體細(xì)胞突起消失，血管周圍水腫明顯；D組可見(jiàn)大腦皮質(zhì)細(xì)胞仍有分層痕跡，少部分錐體細(xì)胞發(fā)生輕微腫脹，細(xì)胞突起有部分?jǐn)嗔?，但?xì)胞內(nèi)胞核大部分完整。

電鏡下超微病理改變：A組皮質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核膜完整，細(xì)胞器及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)正常；缺血再灌注后，B組與C組皮質(zhì)細(xì)胞呈均質(zhì)化，核膜呈節(jié)段性破壞，核周水腫，線粒體嵴斷裂、脫失，基質(zhì)顆粒脫落、消失，線粒體腫脹，呈燒瓶樣或空泡化，數(shù)量明顯減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，核糖體脫落，細(xì)胞膜呈節(jié)段斷裂，細(xì)胞突起消失；D組缺血再灌注損傷后病理改變明顯減輕，可見(jiàn)腦細(xì)胞水腫及血管周圍間隙內(nèi)水腫較輕，皮層細(xì)胞層次基本存在，腦細(xì)胞內(nèi)僅有部分線粒體發(fā)生腫脹，細(xì)胞器膜及核膜損傷較輕。

3 討論

已有組織形態(tài)學(xué)研究表明[8]，腦缺血再灌注后可以發(fā)生嚴(yán)重的組織損傷，主要表現(xiàn)為細(xì)胞及細(xì)胞器的膜損傷，細(xì)胞膜及線粒體膜崩解，核膜出現(xiàn)節(jié)段性損傷，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，核糖體脫落，細(xì)胞胞漿水腫疏松，細(xì)胞突起出現(xiàn)嚴(yán)重水腫甚至消失等。已有證據(jù)表明，腦缺血后再灌注可以導(dǎo)致氧自由基呈爆發(fā)性增加，并攻擊細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜上的不飽和脂肪酸，從而破壞膜的完整性，導(dǎo)致膜功能損傷甚至喪失[9-10]。此外，缺血再灌注損傷還可以導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)DNA、RNA、蛋白質(zhì)和氨基酸發(fā)生交聯(lián)氧化，多糖分子聚合和氧化，不能合成消除氧自由基以及修復(fù)細(xì)胞膜所需的蛋白酶，導(dǎo)致腦細(xì)胞功能的進(jìn)一步惡化，從而使再灌注損傷進(jìn)行性加重。本實(shí)驗(yàn)研究表明，腦缺血30 min，再灌注2 h后，腦組織內(nèi)MDA含量升高，SOD含量降低，ATP酶活力明顯降低，腦組織超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理改變，提示腦缺血再灌注后腦細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷。

眾所周知，線粒體是自由基產(chǎn)生的重要場(chǎng)所。電子漏學(xué)說(shuō)[11-12]解釋了氧自由基的生成途徑。線粒體通過(guò)呼吸鏈電子漏機(jī)制進(jìn)入超氧自由基代謝途徑，生成有害的活性氧（ROS），包括O2-、H2O2等。 呼吸鏈底物端（泛醌區(qū)）及氧端（細(xì)胞色素區(qū)）均有電子漏出，底物端的電子漏導(dǎo)致線粒體生成O2-、H2O2，并還原成H2O，起到部分清除氧自由基的作用。多條代謝途徑的復(fù)雜平衡決定了線粒體生成氧自由基的水平。正常生理狀態(tài)下線粒體產(chǎn)生氧自由基的水平較低，而在腦缺血狀態(tài)下，由于細(xì)胞缺氧，線粒體內(nèi)呼吸鏈處于高底物還原狀態(tài)，此時(shí)的細(xì)胞色素C大部分游離到胞漿中，有利于大量電子漏出及積聚。缺血后再灌注瞬間給處于高還原狀態(tài)的呼吸鏈迅速充氧，使細(xì)胞內(nèi)氧自由基大量急劇生成[13]。在可承受的某一濃度范圍內(nèi)，ROS可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行脅迫應(yīng)答，并通過(guò)改變?cè)S多基因表達(dá)來(lái)維持能量代謝以保護(hù)腦細(xì)胞；但當(dāng)超過(guò)其可承受的臨界值后，ROS便可誘導(dǎo)線粒體膜滲透性發(fā)生改變，導(dǎo)致線粒體腫脹，線粒體功能下降，合成ATP減少，細(xì)胞膜上的各種ATP酶活性下降，導(dǎo)致細(xì)胞膜內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運(yùn)失平衡，細(xì)胞外膜膜電位降低，作為細(xì)胞生死主開(kāi)關(guān)的線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放，使得線粒體基質(zhì)膨脹，線粒體外膜破裂，膜間隙中的細(xì)胞色素C、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、Ca2+以及膜間隙中其他凋亡因子被釋放至細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C可以通過(guò)Apaf-1以級(jí)聯(lián)的方式激活各型胱冬肽酶，而細(xì)胞色素C的釋放與胱冬肽酶的激活之間又形成一個(gè)互相促進(jìn)的反饋性自我放大回路，啟動(dòng)凋亡程序[14]。線粒體間隙內(nèi)的AIF是一種57 kD的雙功能黃素蛋白，除具有電子供體/受體功能以外，還可以獨(dú)立作用于核染色質(zhì)，直接進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，獨(dú)立地將DNA斷解為60 kb左右的片段，引起染色體凝縮和DNA的大規(guī)模斷片化，再灌注損傷可以導(dǎo)致AIF大量釋放[15]。同時(shí)，Ca2+的釋放也可以誘導(dǎo)死亡受體的配體表達(dá)，激活Ca2+依賴性酶、核酸酶、磷酸化酶，協(xié)助激活胱冬肽酶，激活的這些蛋白再以級(jí)聯(lián)反應(yīng)作用于細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，或直接作用于核DNA分子，引起細(xì)胞凋亡[16]。因此，減少氧自由基的生成，降低其對(duì)線粒體的損害，是減輕腦缺血再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。

近年來(lái)，人們?cè)趯?duì)腦缺血急性期血糖水平的大量研究中發(fā)現(xiàn)，腦卒中急性期高血糖的發(fā)生率非常高，其形成原因可能是由于腦卒中引起的機(jī)體應(yīng)激性高血糖：腦卒中導(dǎo)致患者下丘腦-垂體軸受到急性刺激，促腎上腺皮質(zhì)激素分泌異常增多，增多的皮質(zhì)醇可以導(dǎo)致蛋白分解加劇，糖異生原料增加，同時(shí)增加的皮質(zhì)醇也會(huì)抑制葡萄糖的利用，從而間接促進(jìn)了血糖升高。本實(shí)驗(yàn)研究表明，高血糖可以導(dǎo)致機(jī)體氧自由基生成增多，ATP酶活性下降，ATP產(chǎn)生途徑破壞，鈉泵功能障礙，最終導(dǎo)致腦細(xì)胞水腫，同時(shí)糖原在體內(nèi)無(wú)氧酵解也可加速產(chǎn)生乳酸，大量乳酸堆積也可以導(dǎo)致腦水腫加重和酸中毒，使腦梗死面積擴(kuò)大，血腦屏障進(jìn)一步破壞，增加腦出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。高血糖還可增加血液中血小板的黏附力，減少前列環(huán)素的合成，使血液黏滯性增加，腦血管微循環(huán)障礙加重，從而導(dǎo)致卒中復(fù)發(fā)[19]。同時(shí)，人們?cè)诔浞种匾暡⒎e極治療高血糖時(shí)，臨床觀察發(fā)現(xiàn)低血糖同樣危害極大。因?yàn)槟X細(xì)胞無(wú)能量貯備，因此對(duì)血糖的依賴極大，而腦卒中患者的腦細(xì)胞對(duì)低血糖的耐受更差，一旦出現(xiàn)低血糖，腦細(xì)胞的功能最先受損，并可能導(dǎo)致神經(jīng)功能的不可逆損害[20]。

本實(shí)驗(yàn)從腦組織缺血再灌注后，大鼠體內(nèi)不同血糖水平對(duì)腦細(xì)胞氧化還原狀態(tài)及能量代謝的角度，同時(shí)觀察腦組織超微病理結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)了：高血糖及低血糖水平，均可能導(dǎo)致氧化還原酶的破壞及ATP酶活力的下降，而正常高限的血糖水平下氧化還原損傷最小。提示高血糖及低血糖均可造成嚴(yán)重的缺血再灌注腦損傷。組織超微結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)也證明，將血糖水平控制在正常值高限可以明顯減輕缺血再灌注腦損傷。

在長(zhǎng)期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中[21]，局灶性腦缺血及不完全性腦缺血被認(rèn)為更符合臨床缺血性中風(fēng)，因而血糖水平對(duì)不完全性腦缺血再灌注損傷的影響為指導(dǎo)臨床研究及治療提供了新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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