右美托咪定預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注后急性腎損傷的影響

吳文峰 寧 雪 堯永華

廣州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510095

在肝移植或進行某些復(fù)雜的肝臟外科手術(shù)時，為了控制術(shù)中出血，常需要短暫阻斷肝臟的血流，這就造成了肝臟的缺血再灌注損傷，導(dǎo)致肝功能的嚴重損害，繼而導(dǎo)致腦、肺、腎的繼發(fā)性損害[1]。右美托咪定是一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，其藥理作用除了有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮和抑制交感神經(jīng)作用外，現(xiàn)越來越多研究證明還具有臟器保護作用。Arslan等[2]研究表明，右美托咪定能減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷。斯研娜等[3]研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定預(yù)處理和后處理均可減輕腎缺血再灌注損傷，其機制與抑制細胞凋亡作用有關(guān)。但其在預(yù)處理后對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后繼發(fā)的急性腎損傷的保護尚未有研究。本研究通過使用右美托咪定預(yù)處理后，觀察其對大鼠肝臟缺血再灌注后急性腎損傷的保護作用，探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

雄性 SD大鼠 30只，體重 220～300 g，由中山大學實驗動物中心提供?？照{(diào)室內(nèi)飼養(yǎng)，室溫（20±2）℃，相對濕度保持在（55±10）%，自由進食水，術(shù)前 12 h禁食，但不禁水。大鼠隨機分為對照組（S組）、肝臟缺血再灌注組（IR組）、右美托咪定組（Dex組），每組各10只。

1.2 肝臟缺血再灌注模型的建立及處理

腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥位固定，專用小動物面罩吸氧。行尾靜脈穿刺置管，置入24 G靜脈留置針，腹部去毛消毒，腹正中線開腹，游離支配肝左葉及中葉的肝動脈、門靜脈、膽管分支，無創(chuàng)血管鉗夾閉行肝臟部分缺血，缺血60 min后恢復(fù)再灌注，然后用絲線逐層關(guān)腹置鼠籠中恢復(fù)，單籠飼養(yǎng)，禁食但不禁水，維持大鼠肛溫36～37℃。

大鼠麻醉后，S組與IR組以1 mL/(kg·h)速度給予生理鹽水靜滴30 min，間隔2 h后S組僅行開腹手術(shù)，而IR組予肝臟缺血 1 h，再灌注 4 h；Dex組則在30 min內(nèi)給予大鼠 6 μg/kg濃度為 0.25 μg/mL的右美托咪定，間隔2 h后行肝臟缺血1 h，再灌注4 h。

1.3 監(jiān)測指標

再灌注4 h時，腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉后，腹主動脈放血處死，留取右腎及腹主動脈血5 mL。將血液3000 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，分離血清，分裝不同的Eppendorf管中，-20℃冰箱保存。應(yīng)用7600型全自動生化分析儀測定血清尿素氨（BUN）和肌酐（Cr）水平。取右腎組織，液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。稱取0.2 g腎臟組織，加入9倍磷酸鹽緩沖液（PBS），冰浴中制成 10%組織勻漿液，3000 r/min離心10 min，離心半徑為7 cm，取上清夜-80℃保存待測。參照ELISA檢測試劑盒（R.D公司，美國）說明書檢測腎組織腫瘤壞死因-α（TNF-α）含量。參照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書采用化學比色法測定腎組織丙二醛（MDA）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性及髓過氧化物酶（MPO）含量。取腎臟組織，經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋。用切片機進行5 μm厚的連續(xù)切片，然后蘇木精-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察腎組織病理學改變。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用 t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清BUN和Cr水平

IR組與S組和Dex組比較血清BUN和Cr明顯升高（P＜0.05），S組和Dex組比較差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。 見表1。

表1 各組大鼠血清 BUN和 Cr水平（n=10，±s）

表1 各組大鼠血清 BUN和 Cr水平（n=10，±s）

注：與 S組比較，*P ＜ 0.05；與 Dex組比較，#P ＜ 0.05；BUN：血清尿素氮；Cr：肌酐；IR：缺血再灌注損傷

組別 只數(shù)BUN（mmol/L） Cr（μmol/L）S組103.53±0.6852.23±7.67 IR組107.58±0.96*#91.84±10.34*#Dex組104.18±0.7565.64±11.42

2.2 腎組織 TNF-α、MPO、SOD和MDA水平

IR組與S組和Dex組比較TNF-α、MDA水平和MPO 活性明顯升高，SOD 活性明顯下降（P＜0.05）；S組和Dex組比較各項指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腎組織 TNF-α、MPO、SOD 和 MDA 水平（n=10，±s）

表2 各組大鼠腎組織 TNF-α、MPO、SOD 和 MDA 水平（n=10，±s）

注：與 S組比較，*P ＜ 0.05；與 Dex組比較，#P ＜ 0.05；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；MPO：髓過氧化物酶；SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；IR：缺血再灌注損傷

組別 只數(shù)TNF-α（ng/L） MPO（U/g） SOD（U/mgprot） MDA（U/mgprot）S組1051.3±16.21.78±0.4610.91±2.861.28±0.56 IR組10238.4±42.7*#4.73±1.07*#7.48±1.23*#3.66±0.95*#Dex組1069.2±22.32.15±0.8210.21±2.131.98±0.61

2.3 腎臟HE染色切片

S組大鼠細胞結(jié)構(gòu)正常。S組大鼠腎小球系膜區(qū)血管輕度充血，少量細胞空泡變性、腫脹。IR組大鼠腎小管血管充血明顯，部分細胞水腫、空泡變性，間質(zhì)血管充血，可見中性粒細胞浸潤，個別細胞壞死。

3 討論

根據(jù)藥理學實驗相關(guān)的換算公式[5]，大鼠用藥劑量約為成人6.3倍。因此，本研究使用右美托咪定的劑量為6 μg/kg。在本研究里，Cr和BUN是反映腎功能的傳統(tǒng)指標；TNF-a在缺血再灌注損傷過程中是一種十分重要的炎癥介質(zhì)[4]；MDA和SOD則是反映機體內(nèi)氧自由基的生成和清除的情況；MPO是反映組織中中性粒細胞滯留及激活程度。通過觀察這些指標來評估右美托咪定對肝臟缺血再灌注后的急性腎損傷的保護作用。

在本研究里IR組大鼠BUN、Cr水平明顯升高，TNF-α、MDA水平和 MPO活性明顯升高，SOD活性明顯下降，且病理切片出現(xiàn)明顯的細胞腫脹、變性及中性粒細胞浸潤。表明肝臟缺血再灌注后大鼠的腎功能出現(xiàn)了明顯損傷。其可能機制為：一方面，肝臟缺血再灌注損傷通過庫普弗細胞激活TNF-α等炎癥細胞因子，導(dǎo)致大量中性粒細胞在腎臟內(nèi)浸潤，激活的中性粒細胞釋放大量氧自由基和蛋白酶等炎性因子；另一方面，氧自由基在肝臟缺血再灌注后引發(fā)腎損傷的過程中扮演重要角色[5]。它可以激活腎臟內(nèi)的中性粒細胞，兩者共同作用分泌大量的TNF-α等炎癥細胞因子。最終導(dǎo)致腎臟微循環(huán)障礙，血管通透增加性，引發(fā)組織水腫，腎小管血管充血明顯，部分細胞水腫、空泡變性，間質(zhì)血管充血，嚴重損害腎功能。而在Dex組里，BUN、Cr、TNF-α、MPO、SOD、MDA 與 S 組比較差異無統(tǒng)計學意義，這說明右美托咪定能通過降低TNF-α的水平，減少由于炎癥介質(zhì)活化所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)級聯(lián)效應(yīng)；減少氧自由基含量（SOD活力增高減少MDA生成），抑制中性粒細胞聚集，從而減輕對腎臟功能的損傷。

藥物預(yù)處理[6]（pharmacological preconditioning，PPC）因為其安全性和操作簡單，近年成為研究熱點。丁冠南等[5]研究表明，丙泊酚預(yù)處理可明顯減輕肝臟缺血再灌注后急性腎損傷，其機制與抑制炎癥因子的分泌，減輕氧化應(yīng)激有關(guān)。陳暉等[7]也發(fā)現(xiàn)丙泊酚能減少氧自由基生成從而保護腎功能。而Jung等[8]和Lv等[9]的觀點也支持本研究結(jié)果。

此外，右美托咪定是一種新型的高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，能減弱外科手術(shù)引起的應(yīng)激反應(yīng)[10]，降低血漿兒茶酚胺濃度和血液循環(huán)中和組織局部的去甲腎上腺素濃度，避免了去甲上腺素誘導(dǎo)血管收縮導(dǎo)致的不利影響。當循環(huán)量減少時，這有助于維持腎血流量和腎小球濾過[11-12]。另有研究表明，右美托咪定可加腎小球濾過，增加腎臟的水和鈉的排泄，增加尿量，從而對腎臟起到保護作用[13-14]。

綜上所述，右美托咪定可通過抑制炎性因子TNF-α，減少氧自由基生成，抑制中性粒細胞聚集來保護肝臟缺血再灌注損傷后的腎功能損傷。此外，還可通過減弱應(yīng)激反應(yīng)，增加腎臟水鈉排泄等作用保護腎功能，但其具體機制還需進一步研究。

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