單味中藥對兔球蟲卵囊孢子化抑制效果的研究

高俊峰，王卓林，侯美如，李桂偉，王麗坤

（1.黑龍江省獸醫(yī)科學(xué)研究所，齊齊哈爾161006；2.哈爾濱北方森林動物園）

兔球蟲病呈世界性流行，我國各地均有發(fā)生，是影響?zhàn)B兔業(yè)健康發(fā)展最棘手的疾病之一。各個品種和各年齡段的家兔均有易感性，給養(yǎng)兔業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，一些兔場甚至由于爆發(fā)兔球蟲病而倒閉。目前球蟲病的治療以化學(xué)藥物為主，具有見效快、使用方便的優(yōu)點(diǎn)，但因長期使用已產(chǎn)生了耐藥性和存在藥物殘留。在免疫預(yù)防方面，雞球蟲的免疫已初見成效，而兔球蟲免疫由于產(chǎn)業(yè)局限性，還未見有研發(fā)報(bào)道。

兔感染球蟲，是由于吞食了散布在土壤、地面、飼料和飲水等外界環(huán)境中的具有感染性的孢子化卵囊而引起的，而未孢子化的卵囊不具備感染能力。因此，有效的控制卵囊孢子化對預(yù)防兔球蟲病具有重要意義。但是，球蟲卵囊對惡劣的外界環(huán)境條件和消毒劑具有很強(qiáng)的抵抗力，而且在合適的溫度、濕度和氧氣條件下短時(shí)間內(nèi)就可以孢子化。為了降低、減慢卵囊孢子化程度，人們試驗(yàn)了多種球蟲卵囊消毒手段，中草藥就是其中的一項(xiàng)。這是因?yàn)槲覈侵胁菟幍陌l(fā)源地，目前大約有12 000種藥用植物，這是其他國家所不具備的，而且中藥消毒不易產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留，使用相對安全，具有廣闊的發(fā)展前景[1]。為此，研究選取仙鶴草、常山等13種中藥進(jìn)行體外抑制兔球蟲卵囊孢子化試驗(yàn)，以期為新型兔球蟲消毒劑的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)中藥

仙鶴草、白頭翁、青蒿、苦楝皮、柴胡、大黃、地榆、使君子、鴉膽子、馬鞭草、常山、甘草、檳榔，購自黑龍江省齊齊哈爾市解放門藥店（質(zhì)量均符合中華人民共和國2010年版藥典標(biāo)準(zhǔn)）。每味藥按中藥提取工藝，制成含生藥1.00 g·mL-1的提取液，備用。

1.2 試驗(yàn)動物及卵囊

30日齡幼兔，經(jīng)卵囊檢查無球蟲后購回4只，在無清潔環(huán)境中飼養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn)；兔球蟲卵囊，分離自大慶市龍鳳區(qū)某兔場，由研究所保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 球蟲卵囊增殖及制備

對上述保存的球蟲卵囊進(jìn)行計(jì)數(shù)，以5×104卵囊/只的劑量感染幼兔，感染后第7 d剖殺，刮取盲腸內(nèi)容物，分離、純化卵囊，計(jì)數(shù)后供試驗(yàn)用。

1.4 方法

分別對13味中藥抑制卵囊孢子化進(jìn)行評價(jià)。具體步驟為：取小平皿若干，分別加入預(yù)先稀釋好的含2×104個·mL-1未孢子化球蟲卵囊懸液10mL，再分別加入質(zhì)量百分濃度為100%（1 g·mL-1）、50%（0.5 g·mL-1）和25%（0.25 g·mL-1）的中草藥提取液10mL，另外設(shè)加入2.5%的重鉻酸鉀溶液10 mL和加入蒸餾水10mL的對照組。將每組液體充分混勻，放置于28℃下恒溫培養(yǎng)，每6 h將各組搖動一次。分別于第2、3、4 d計(jì)數(shù)，并計(jì)算每組的卵囊孢子化率。然后，洗去中藥組的中藥液，加等量2.5%的重鉻酸鉀溶液，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)，于第5、6、7 d分別計(jì)數(shù)、計(jì)算每組的孢子化率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選出對兔球蟲卵囊孢子化具有一定效果的中草藥，進(jìn)一步觀察其不同濃度對兔球蟲卵囊孢子化率的影響。

2 結(jié)果

2.1 不同中草藥對兔球蟲卵囊孢子化的影響

選用的13種中草藥（見表1）在同濃度單味中藥培養(yǎng)條件下，大部分中藥隨著時(shí)間的延長，卵囊孢子化率有不同程度的升高，而鴉膽子隨著時(shí)間的延長，卵囊孢子化率沒有升高，反而趨于下降。白頭翁、苦楝皮、大黃、地榆、甘草、檳榔等中草藥對兔球蟲孢子化抑制效果一般（孢子化率為57.67%～77.67%）；仙鶴草、青蒿、柴胡、使君子、馬鞭草、常山等中藥對兔球蟲孢子化有一定程度的抑制作用（孢子化率為33.67%～44.67%）；而鴉膽子對兔球蟲孢子化具有顯著的抑制作用（孢子化率為28.67%）。洗去中藥后，兔球蟲在重鉻酸鉀環(huán)境中仍可繼續(xù)生長，這說明單味中藥對卵囊不能有效殺滅，即脫離開中藥環(huán)境，兔球蟲仍可繼續(xù)發(fā)育。

表1 不同單味中藥對兔球蟲卵囊孢子化的影響Table1 Sporulated rate of oocystswith different time by single chinese herbalmedicine

續(xù)表1不同單味中藥對兔球蟲卵囊孢子化的影響Continued Table1 Sporulated rate of oocystswith different time by single chinese herbalmedicine

2.2 不同濃度中草藥對兔球蟲卵囊孢子化的影響

將篩選出的7種中草藥稀釋成不同的濃度，研究對卵囊孢子化的抑制差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，仙鶴草、常山、青蒿、鴉膽子濃度的增高，可以明顯影響卵囊的孢子化；而馬鞭草、使君子、柴胡隨濃度的增高，球蟲卵囊孢子化率改變不明顯。多數(shù)中草藥以100%濃度抑制球蟲卵囊效果優(yōu)于50%和25%的濃度（見表2）。

表2 單味中藥濃度對兔球蟲卵囊孢子化的影響Table2 Sporulated rate of oocystswith different concentration by single chinese herbalmedicine

3 討論

兔球蟲病是由艾美耳屬的一種或多種球蟲寄生于兔的腸道[2]或肝臟[3]所引起的原蟲病，是兔場的一種常見、多發(fā)性疾病，是嚴(yán)重危害兔只的主要疾病之一。兔球蟲的發(fā)育過程經(jīng)歷三個階段：裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖，其中球蟲卵囊的孢子化是球蟲發(fā)育的一個重要環(huán)節(jié)，只有卵囊孢子化才會對動物具有致病性[4]。但是，不同動物球蟲孢子化的時(shí)間都不盡相同。如：寄生于黃牛的邱氏艾美爾球蟲（E.zuernii）卵囊孢子化時(shí)間約為48～72 h；綿羊阿沙塔艾美爾球蟲（E.ahsata）卵囊孢子化時(shí)間為36～72 h；豬平滑艾美爾球蟲（E.polita）卵囊的孢子發(fā)育時(shí)間為7～9 d；雞柔嫩艾美爾球蟲（E.tenella）卵囊孢子化時(shí)間一般為18～48 h；而兔中形艾美爾球蟲（E.media）卵囊孢子化時(shí)間為48～72 h[5]。可見，由于寄生宿主和球蟲種類不同，卵囊孢子化時(shí)間亦不相同，但其中機(jī)理還不明確。

球蟲的卵囊對化學(xué)試劑具有頑強(qiáng)的抵抗力，化學(xué)消毒劑對球蟲卵囊孢子化抑制效果并不理想[6]，雖高濃度氨水[7]，溫度[8]和紫外線[9]等因素對球蟲卵囊孢子化抑制效果明顯，但不適用于密集飼養(yǎng)的條件。雖然磺胺類藥物對球蟲的治療有顯著的效果，可是在抑制卵囊方面效果一般[9]。所以，近年來許多學(xué)者對中草藥抑制卵囊孢子化產(chǎn)生了興趣。葛凱[10]等對23味中草藥進(jìn)行試驗(yàn)，篩選有效體外抗雞柔嫩艾美爾球蟲中草藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)商陸等具有較好的抑制作用，且藥物濃度越高，抑制效果越好。張文香[11]等人選用常山、青蒿、白頭翁對柔嫩艾美爾球蟲孢子化的抑制作用進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)所用中草藥對球蟲卵囊的孢子化均有明顯的抑制作用，其中白頭翁、秦皮（1.00 g·mL-1）抑制效果最好；長時(shí)間（6 d）處理以白頭翁、青蒿效果最好。王璽德[12]等利用石榴皮水提取物、石榴皮多酚、石榴皮黃酮對多種混合兔球蟲卵囊進(jìn)行孢子化抑制試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)石榴皮提取物對體外培養(yǎng)的兔球蟲卵囊孢子化有較強(qiáng)的殺滅作用。其中，石榴皮水提物對兔球蟲卵囊殺滅作用最強(qiáng)，石榴皮黃酮和石榴皮多酚次之。張國[13]將未孢子化的斯氏艾美爾球蟲卵囊分別在蒲公英、青蒿、白頭翁、秦皮四種中草藥提取液中培養(yǎng)，觀察中草藥對球蟲卵囊孢子化的影響，結(jié)果表明所用中草藥對球蟲卵囊的孢子化率有一定的抑制作用，其中白頭翁的抑制效果最好，青蒿的抑制效果最差。

依據(jù)中獸醫(yī)理論，并參考先前報(bào)道的具有抑制雞球蟲卵囊孢子化的中草藥，研究所選取的13種中草藥均具有驅(qū)蟲效果，但試驗(yàn)結(jié)果表明，僅個別中草藥對兔球蟲卵囊孢子化具有顯著抑制效果，大部分藥物對抑制兔球蟲卵囊孢子化效果不理想，結(jié)果與一些文獻(xiàn)報(bào)道不完全一致[10-11，13]，這可能與不同宿主的球蟲種類不同有關(guān)。因此，要篩選出有效的兔球蟲卵囊消毒劑，除考慮中草藥本身的內(nèi)服功效外，還需對中藥體外作用機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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