黑龍江省和吉林省稻瘟病菌種群多樣性研究

張亞玲，王寶玉，臺(tái)蓮梅，左豫虎，鄭雯，鄧本良，靳學(xué)慧

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，大慶163319）

稻瘟病是由稻瘟病菌Magnaporthe oryzae B.Couch（無(wú)性態(tài)：Pyricularia oryzae Cavara以前為Magnaporthe grisea（Hebert））Barr.引起的，是對(duì)水稻產(chǎn)量損失影響最大的一種病害[1-2]。長(zhǎng)期實(shí)踐表明，控制此病害最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的措施是培育和合理利用抗病品種[3]，然而由于稻瘟病菌群體發(fā)生變異而引發(fā)新的致病小種的出現(xiàn)導(dǎo)致了新選育品種的抗性只能維持短期的效應(yīng)[4]。因此研究稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)能夠更好地了解稻瘟病菌在田間的組成，對(duì)于抗病品種的選育和合理使用有一定的理論意義。對(duì)于稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)研究人們利用最多的方法是致病性鑒定的方法進(jìn)行，對(duì)稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)研究起到了重要的作用，但隨著生物技術(shù)的發(fā)展生物技術(shù)手段已經(jīng)完全滲入到生物類群體結(jié)構(gòu)研究中。Hamer等[5]從稻瘟病菌中分離得到一組散布中等重復(fù)序列的DNA片段，在稻瘟菌基因組中有豐富的多態(tài)性。從此，DNA指紋分析在稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)分析中得到廣泛應(yīng)用。Pot2-rep-PCR是基于中等重復(fù)序列的一種PCR擴(kuò)增技術(shù)[6]。利用Pot2-rep-PCR技術(shù)對(duì)我省水稻主產(chǎn)區(qū)的49個(gè)稻瘟病菌菌株進(jìn)行群體遺傳分析，為北方稻區(qū)水稻抗瘟品種的合理使用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

參試的菌株共有49個(gè)，其中黑龍江省稻菌株23個(gè)，吉林稻瘟病菌菌株26個(gè)（表1）。

表1 試驗(yàn)菌株Table1 Magnaporthe grisea Isolates used in the study and serial number

1.2 病原菌的單孢分離

取稻瘟病穗頸瘟發(fā)病部位于培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)24 h，當(dāng)發(fā)病部位產(chǎn)生孢子后在PDA（1 000 mL水，15 g葡萄糖，12 g瓊脂粉）培養(yǎng)基上采用震落的方法使孢子落于平板培養(yǎng)基上，于25℃下培養(yǎng)36 h，長(zhǎng)出菌落后在無(wú)菌條件下通過(guò)顯微鏡調(diào)取單菌落。

1.3 菌絲的培養(yǎng)及DNA的制備

將供試菌株活化于米糠培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后，挑取4塊新鮮菌絲塊（0.5×0.5 cm）接種于經(jīng)高壓滅菌的液體酵母培養(yǎng)基中。然后置于搖床中28℃恒溫，170 rpm振蕩培養(yǎng)2～3 d，待菌絲體生長(zhǎng)茂盛且未變黑時(shí)，用滅菌的紗布和濾紙真空過(guò)濾，再用滅菌蒸餾水抽洗2次，最后用濾紙盡可能地將菌絲中的水吸干，并分裝于1.5mL離心管中，置于-20℃冰箱中冷凍保存。

將研缽洗凈，于120℃干熱滅菌，冷卻備用。取約150 mg的凍干菌絲置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮，研磨（3～4次）至粉末狀，然后，用DNA抽提試劑盒（E.Z.N.A.〇RFungal DNA Kit，Omega公司，美國(guó)）對(duì)基因組DNA進(jìn)行抽提，其提取方法參照試劑合說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.4 Pot2-Rep-PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增引物序列：Pot2-1 5’-CGGAAGCCCTAAA GCTGTTT-3’Pot2-2 5’-CCCTCATTCGTCAC ACGTTC-3’

由Sangon（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）公司合成。擴(kuò)增體系及反應(yīng)過(guò)程如下：

擴(kuò)增所采用25μL體系。滅菌雙純水12.5μL，引物Pot2-1（25 pmol），Pot2-2（25 pmol）各1μL，dNTP（mM）1μL，含水量Mg2+Buffer 2μL，模板1μL，DNA Taq 0.2μL。反應(yīng)循環(huán)：94℃5min，變性95℃2.5 min；4個(gè)循環(huán)的變性94℃1 min，退火62℃1min，延伸65℃10min；26個(gè)循環(huán)的變性94℃30 s，退火62℃1min，延伸65℃10min；最后65℃延伸15min。擴(kuò)增完畢后取12.5μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。

1.5 擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

rep-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.6 數(shù)據(jù)處理

把電泳照片上的擴(kuò)增條帶轉(zhuǎn)換成2進(jìn)制數(shù)據(jù)，即有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”；按Percent disagreement遺傳距離公式計(jì)算相似系數(shù)；然后用Statistica中的UPGA（Unweightedpair-group average）聚類分析得到反映菌株親緣關(guān)系的樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 rep-PCR遺傳譜型分析

用一對(duì)引物（Pot2-1/Pot2-2）對(duì)49個(gè)供試菌株均有較好擴(kuò)增效果，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，可獲得穩(wěn)定、清晰明亮的譜帶。結(jié)果顯示所有供試菌株分別擴(kuò)增到1～16條帶，大小從100 bp到3 kb之間（圖1），特異性譜帶共有16條，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)49個(gè)菌株都共有的保守帶，可見稻瘟病菌群體存在豐富的遺傳多樣性。說(shuō)明稻瘟菌在DNA水平上具有高度的異質(zhì)性。利用UPGA聚類分析，所有的菌株遺傳距離在0.20水平上可將供試的菌株劃分為20個(gè)遺傳譜，其中第2個(gè)譜系為優(yōu)勢(shì)譜系，黑龍江省有11個(gè)菌株，吉林省有9個(gè)菌株；其次是譜系1有黑龍江省1個(gè)菌株，吉林3個(gè)菌株；其中譜系2是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)系譜，含有的單型數(shù)目超過(guò)40%；其他19個(gè)系譜的單型數(shù)都為1～10。

圖1 部分稻瘟病菌菌株P(guān)CR電泳圖Fig.1 Partof the rice blast fungus strains PCR electrophoregram

2.2 不同稻區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性

分析結(jié)果表明，20個(gè)系譜內(nèi)含有的菌株數(shù)差異明顯，第2個(gè)譜系是優(yōu)勢(shì)譜系，黑龍江省的吉林省的供試菌株以接近于1∶1的組成分布在這個(gè)譜系內(nèi)；第1譜系內(nèi)有4個(gè)菌株，其中有3個(gè)是吉林省菌株。從圖2可以看出吉林菌株JMTY130-1菌株與其他菌株明顯不同，在擴(kuò)增時(shí)能擴(kuò)增出條帶，只能擴(kuò)出2條，其他菌株擴(kuò)增4～12條不等。雖然供試菌株數(shù)量不多，但在一定程度上顯現(xiàn)出菌株遺傳背景不同。指紋圖譜遺傳相似性聚類分析顯示：地區(qū)間差異極其明顯。以0.20相似性水平劃分遺傳系譜，49個(gè)菌株可劃分在20個(gè)系譜中（圖2）。根據(jù)聚類分析黑龍江省和吉林省參試菌株所占系譜數(shù)與參試菌株數(shù)的比例來(lái)看，參試稻瘟菌株遺傳多樣性程度黑龍江?。ㄏ底V數(shù)/菌株數(shù)）黑龍江省（7/23=0.304 3）、吉林?。?1/26=0.423 0），這個(gè)研究結(jié)果雖然與采樣數(shù)量有關(guān)，但也間接反應(yīng)了黑龍江與吉林兩省稻瘟病菌的遺傳多樣性的程度，從兩個(gè)省的菌株在譜系中有交叉存在的現(xiàn)象也說(shuō)明黑龍江省菌株和吉林菌的遺傳比較相似。譜系3主要以黑龍江省菌株存在，說(shuō)明譜系3是黑龍江省特有的譜系類型。

圖2 49個(gè)供試稻瘟病菌菌株遺傳距離聚類圖Fig.2 Tree diagram derived from gengetic of 49 strains of Pyricularia oryzae Cav

3 討論

人們采用多種方法對(duì)稻瘟病菌遺傳多樣性進(jìn)行研究，如SRAP方法[3]、RAPD方法[4]、RFLP方法[5-6]等，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究人員研究發(fā)現(xiàn)rep-PCR技術(shù)是簡(jiǎn)單實(shí)用的一種研究稻瘟病菌種群多樣性的技術(shù)[7-8]，周益軍等[9]利用Pot2-rep-PCR技術(shù)對(duì)收集自我國(guó)14個(gè)省水稻產(chǎn)區(qū)的324個(gè)稻瘟病菌株進(jìn)行了DNA指紋分析。稻瘟病菌在DNA水平上的變異比較高，具有很豐富的多態(tài)性，在20%的遺傳距離水平上，170個(gè)單型被劃分成20個(gè)遺傳系譜。2004年周益軍等[10]對(duì)亞洲五國(guó)的稻瘟病菌遺傳多樣性進(jìn)行了研究，將不同地點(diǎn)的稻瘟病菌劃分為不同的譜系。這些研究結(jié)果都說(shuō)明利用Pot2-rep-PCR技術(shù)對(duì)稻瘟病菌群體組成的研究有應(yīng)用價(jià)值。

稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)差異的原因我多種可能，但主要分為兩大類，一類是氣候條件，另一類是品種及品種的合理使用[11]。作者認(rèn)為稻瘟病菌的變異受多種因素共同影響，是一個(gè)長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程，稻瘟病菌群體結(jié)構(gòu)因年度和地區(qū)變化是很顯著的，稻瘟病菌具有高度的遺傳多樣性和變異性及較強(qiáng)的時(shí)空局限性[6]。通過(guò)對(duì)黑龍江省和吉林省稻瘟病菌種群結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，兩省稻瘟病菌的種群結(jié)構(gòu)存在豐富的多樣性，吉林省遺傳多樣性要強(qiáng)一些，這可能與吉林省地理位置在黑龍江省以南，受氣候條件影響，吉林省可種植的品種要比黑龍江多些，這對(duì)稻瘟病菌的種群結(jié)構(gòu)也會(huì)產(chǎn)生影響。另外研究所采用的菌株數(shù)量有限，不一定能完全說(shuō)明黑龍江省和吉林省稻瘟病菌遺傳多樣性差異，可能會(huì)與田間實(shí)際情況有所不同，為進(jìn)一步分析稻瘟病菌在田間的種群多樣性還需要大量采集代表地區(qū)稻瘟病菌做進(jìn)一步的研究分析。

Pot2-rep-PCR是基于中等重復(fù)序列的一種PCR擴(kuò)增技術(shù)[12]，具有簡(jiǎn)單，分辨能力高的優(yōu)點(diǎn)，在DNA指紋分析在稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)分析中得到廣泛應(yīng)用，有許多的研究者利用Pot2-rep-PCR對(duì)國(guó)內(nèi)外各不同稻區(qū)稻瘟菌株進(jìn)行了分析，得到了不同的研究結(jié)果，由于各自的研究分析方法有所不同，所得結(jié)果不能進(jìn)行比較分析。因此，探索發(fā)現(xiàn)其他可能途徑以對(duì)病原菌DNA指紋進(jìn)行分析是目前病原菌群體結(jié)構(gòu)研究的重點(diǎn)。

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