龍須菜RSAP分析及其SCAR標(biāo)記的轉(zhuǎn)化*

王津果，隋正紅，周 偉，馬金華，張 淑，常連鵬

（中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003）

RSAP是由杜曉華于2006年首次提出的一種新型DNA分子標(biāo)記技術(shù)，具有步驟簡(jiǎn)單、檢測(cè)位點(diǎn)較多、成本較低等優(yōu)勢(shì)，未獲得全基因組測(cè)序結(jié)果以前，在遺傳多樣性分析、連鎖圖譜構(gòu)建和基因定位等方面具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值［1］。張明科［2］進(jìn)一步研究了該技術(shù)的引物設(shè)計(jì)并優(yōu)化了反應(yīng)體系。喬利仙［3］與辛本華［4］先后將該技術(shù)應(yīng)用到重樓屬植物的遺傳多樣性分析與紅藻門紫菜遺傳多樣性及種質(zhì)鑒定方面。

目前，經(jīng)青島湛山灣野生種群選育而來(lái)的栽培品系981、07－2已在福建南部海區(qū)［5］、廣東省汕頭市南澳島等地栽培多年［6］，并在浙江、山東及遼寧沿海建立了龍須 菜 （Gracilariopsis lemaneiformis）栽 培 產(chǎn) 業(yè)［7］。栽培品系由于多年的無(wú)性繁殖而引起種質(zhì)退化，野生資源由于沿岸改造與人為干擾，其分布面積逐漸減少。因此，為適應(yīng)龍須菜產(chǎn)業(yè)化規(guī)模不斷擴(kuò)大的現(xiàn)狀，如何保護(hù)野生資源的遺傳多樣性并使之可持續(xù)利用變得日益重要。本研究以湛山灣野生群體和栽培品系為材料，運(yùn)用RSAP技術(shù)從基因組DNA水平上，分析等位基因及頻率、遺傳雜合度、多態(tài)信息含量等，旨在從分子水平上探討龍須菜不同群體的的遺傳差異，為龍須菜種質(zhì)資源的保護(hù)和可持續(xù)利用以及遺傳育種工作提供理論依據(jù)。

SCAR標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于一些形態(tài)上難以區(qū)分而且經(jīng)濟(jì)價(jià)值差異較大的種和品種鑒別及種質(zhì)評(píng)價(jià)［8］。本研究通過(guò)分析RSAP指紋圖譜，以期篩選獲得龍須菜生產(chǎn)上的主要苗種來(lái)源981的特異條帶，并將其轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定可靠、特異性高的SCAR標(biāo)記。通過(guò)利用特異的SCAR標(biāo)記鑒定優(yōu)良的龍須菜栽培品系981，可以防止或減少使用不合格品系給龍須菜生產(chǎn)造成的損失。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)用龍須菜為2010年10月分別采自青島膠州灣養(yǎng)殖海區(qū)和青島湛山灣的981、07－2和湛山灣野生四分孢子體。將采集來(lái)的樣品切片，置于顯微鏡下觀察，在皮層細(xì)胞中分布有呈十字形分裂的四分孢子囊的藻株即為四分孢子體［9］。選取10株湛山灣野生四分孢子體與栽培品系981、07－2分別2個(gè)樣品，在海水中用消毒毛刷除掉附著的雜藻和泥砂后，用蒸餾水沖洗1次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 龍須菜基因組DNA的提取 采用天根植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH，北京）提取龍須菜的基因組DNA，紫外分光儀測(cè)定濃度，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA分子的完整性。

1.2.2 RSAP分析 RSAP的分析參照杜曉華等［1］的方法并作了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。其中引物由上海生工技術(shù)有限公司合成，引物序列如表1。6個(gè)引物可分別與其它任何1個(gè)引物組合而得到15對(duì)引物，利用這15對(duì)引物對(duì)14個(gè)龍須菜樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20μL PCR反應(yīng)體系中各反應(yīng)物含量：2μL 10×PCR buffer，30ng 基 因 組 DNA，2.5mmol·L－1MgCl2，0.15 mmol·L－1dNTPs，0.4μmol·L－1引 物，2UTaq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)在杭州朗基96孔精品型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min，前5個(gè)循環(huán)為94℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min；接下來(lái)30個(gè)循環(huán)為：94℃變性1min，46℃退火1min，72℃延伸1min；最后72℃延伸5min。結(jié)束后產(chǎn)物進(jìn)行4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）進(jìn) 行 分析，銀染［10］。

表1 RSAP分析與SCAR驗(yàn)證所用的引物Table 1Information of the primers used in RSAP analysis and SCAR verification

1.2.3 RSAP數(shù)據(jù)分析 人工觀察統(tǒng)計(jì)電泳條帶，以擴(kuò)增清晰的帶為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)記分析，將電泳圖譜中的每一條帶的遷移位置記為一個(gè)位點(diǎn)，相同遷移位置的擴(kuò)增帶出現(xiàn)時(shí)記為1，缺失和模糊不清時(shí)記為0，構(gòu)建0－1矩陣。運(yùn)用PopGen［11］分析種群內(nèi)的遺傳多樣性：觀測(cè)到的等位基因數(shù)，Na、有效等位基因數(shù)，Ne、平均基因多樣性指數(shù)，H以及Shannon多樣性信息指數(shù)，I；種群間的遺傳多樣性：種群內(nèi)總的基因多樣性，Ht、種群內(nèi)的基因多樣性，Hs、種群間的基因分化度，Gst、基因流，Nm；計(jì)算出遺傳距離，D，采用MEGA5.0軟件按UPGMA法進(jìn)行聚類。

1.2.4 981特異條帶目的回收與測(cè)序 將篩選到的特異條帶，按照 Poly－gel DNA extraction kit（OMEGA，上海）說(shuō)明進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠膠回收。以回收回來(lái)的DNA片段為模板，進(jìn)行20μL×5的放大PCR，擴(kuò)增程序參照RSAP的反應(yīng)程序。放大PCR的產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，100μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳后，運(yùn)用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit按照說(shuō)明書進(jìn)行回收。

目的片段的連接按照pMDTM18－T Vector說(shuō)明書進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化后平板培養(yǎng)，隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行目的片段檢測(cè)。陽(yáng)性克隆在1mL含Amp的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，加終濃度20%甘油，經(jīng)由上海生工3730測(cè)序儀進(jìn)行單向測(cè)序。

1.2.5 SCAR引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證 使用NCBI的Vec Screen對(duì)測(cè)序后的DNA片段在線去除載體序列，然后在GenBank里面比對(duì)是否有同源序列。此外，將整理過(guò)的序列載入軟件Primer Premier 5.0，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，在序列兩端設(shè)計(jì)特異引物，并送上海生工合成。參照1.1提取981、07－2各2株和30株湛山灣野生四分孢子體的基因組DNA，確定SCAR引物的退火溫度并進(jìn)行驗(yàn)證PCR，程序如下：94℃變性5min；94℃變性1min，54℃（SCAR引物1）／65℃（SCAR引物2）退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行目的片段的檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RSAP擴(kuò)增結(jié)果

15對(duì)引物在10株湛山灣野生四分孢子體、2個(gè)981樣品、2個(gè)07－2樣品共計(jì)14個(gè)樣品中擴(kuò)增出669個(gè)位點(diǎn)。龍須菜14個(gè)樣品的RSAP聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增條帶情況見(jiàn)圖1。

圖1 龍須菜14個(gè)樣品的RSAP聚丙烯酰胺凝膠電泳擴(kuò)增結(jié)果圖示Fig.1 RSAP amplification result of 14samples of G.lemaneiformis resolved by PAGE analysis

由圖1可見(jiàn)，青島湛山灣野生四分孢子體與栽培品系981、07－2的RSAP擴(kuò)增片段大小在100～1 000bp，群體間差異條帶少，群體內(nèi)各個(gè)體間的差異條帶更少。

2.2 龍須菜各群體內(nèi)的RSAP分析

湛山灣野生和栽培品系981、07－2種群內(nèi)的平均觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、平均基因多樣性指數(shù)即平均雜合度（H）以及Shannon多樣性信息指數(shù)（I）、多態(tài)性位點(diǎn)比率（P／%）見(jiàn)表2。

表2 各群體內(nèi)的遺傳多樣性Table 2 The diversity of every group

由表2可以看出，各群體內(nèi)多態(tài)性位點(diǎn)比率（P／%）都很低，最低的為栽培品系981，多態(tài)性比率不到0.2%，栽培品系07－2多態(tài)性位點(diǎn)比率最高，為0.9%，這反應(yīng)了龍須菜各群體內(nèi)部遺傳變異水平是非常低的。各群體的有效等位基因數(shù)Ne在1.002 1～1.007 1之間，湛山灣野生群體與栽培品系有效等位基因數(shù)差別不大，有效等位基因數(shù)最大的是湛山灣野生群體，達(dá)到了1.007 1。各群體內(nèi)的基因多樣性指數(shù)H在0.001 2～0.003 7之間，該指數(shù)的值也是較低的。Shannon指數(shù)I，分布在0.001 8～0.005 4之間，最大的為栽培品系07－2。I值表示群體的基因變異程度，各群體的I值普遍很低，說(shuō)明了各群體的基因變異程度低。各群體的有效等位基因數(shù)Ne和基因多樣性指數(shù)H 以及Shannon指數(shù)I的變化趨勢(shì)是一致的。

2.3 湛山灣野生與栽培品系981、07－2種群間RSAP分析

種群內(nèi)總的基因多樣性Ht、種群內(nèi)的基因多樣性Hs、種群間的基因分化度Gst、基因流Nm見(jiàn)表3。所有群體內(nèi)總的基因多樣性Ht為0.095 3，大于各群體內(nèi)的基因多樣性系數(shù) Hs為（0.002 9），而湛山灣野生與2個(gè)栽培品系群體之間兩兩分析結(jié)果顯示，任何2個(gè)群體的總基因多樣性均小于0.01。由此可見(jiàn)，各群體間的基因多樣性主要來(lái)自湛山灣的樣品和栽培品系樣品之間的差異。所有群體間的基因流為0.015 5，小于1，表現(xiàn)出很低的基因流動(dòng)性，表明群體間幾乎不存在基因流動(dòng)。各群體間的基因分化度Gst也均大于0.5，說(shuō)明在所有檢測(cè)的樣品中，遺傳多樣性多來(lái)自不同群體間的多樣性。

湛山灣野生與2個(gè)栽培品系981、07－2群體個(gè)體間的遺傳距離見(jiàn)表4，利用UPGMA方法對(duì)龍須菜野生群體與2個(gè)栽培品系進(jìn)行聚類分析，相應(yīng)的UPGMA聚類樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖2 龍須菜群內(nèi)總的UPGMA法遺傳聚類圖Fig.2 The UPGMA dendrogrom of all the strains of G.lemaneiformis using genetic distance

表3 種群間的基因多樣性Table 3 Gene diversity of inter－groups of G.lemaneiformis

表4 14個(gè)個(gè)體間的遺傳距離Table 4 Genetic distance between 14 G.lemaneiformis

由圖2可以看出，1～10號(hào)樣品為一個(gè)群體，11～12號(hào)樣品為一個(gè)群體，13～14號(hào)樣品為一個(gè)群體，與14個(gè)樣品分屬于3個(gè)不同群體相一致，1～10號(hào)為屬于湛山灣野生群體，11～12號(hào)屬于栽培品系981、13～14號(hào)屬于栽培品系07－2。由聚類圖可以看出，各群體間的遺傳距離小，群體間遺傳距離最長(zhǎng)在0.17左右，而群體內(nèi)的遺傳距離均低于0.01。

2.4 目的片段的回收、測(cè)序以及SCAR引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

圖3 SCAR引物2對(duì)龍須菜新個(gè)體的驗(yàn)證PCR電泳圖Fig.3 Agarose gel profile of G.lemaneiformis individuals amplified with the SCAR primer 2

將篩選得到的栽培品系981特異的片段回收測(cè)序后，得到大小分別為620bp、542bp的2條片段。在序列兩端設(shè)計(jì)SCAR引物，引物信息見(jiàn)表1。SCAR引物2對(duì)981、07－2各3株和30株湛山灣野生四分孢子體共計(jì)36株龍須菜的擴(kuò)增結(jié)果如圖3，擴(kuò)增片段大小為442bp，SCAR引物1擴(kuò)增結(jié)果與SCAR引物2擴(kuò)增結(jié)果一致，片段大小為616bp。結(jié)果表明，2對(duì)特異SCAR引物對(duì)981基因組DNA可以擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異條帶，而在07－2和湛山灣野生四分孢子體中均無(wú)擴(kuò)增條帶。

3 討論

RSAP技術(shù)的PCR擴(kuò)增程序借鑒了SRAP［12］技術(shù)，引物的設(shè)計(jì)借鑒了RAPD［13］隨機(jī)序列的模糊匹配原理。從操作步驟上講，RSAP技術(shù)是AFLP［14］的極大簡(jiǎn)化；從基因組的擴(kuò)增區(qū)域上講，RSAP是對(duì)SRAP和TRAP［15］的有效補(bǔ)充。因?yàn)楹髢烧咧饕槍?duì)單拷貝區(qū)擴(kuò)增，而RSAP擴(kuò)增的限制性位點(diǎn)則散布于整個(gè)基因組區(qū)（包括重復(fù)區(qū)和單拷貝區(qū)）。RSAP標(biāo)記技術(shù)是一個(gè)操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率中等、可靠穩(wěn)定、適用性較廣的一種分子標(biāo)記技術(shù)，已經(jīng)在植物的多種研究中成功應(yīng)用［1－4］。

采用1條RSAP引物，無(wú)論含6bp或含4bp的限制性位點(diǎn)識(shí)別序列的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均不能擴(kuò)增或很少擴(kuò)增出條帶；而采用2條不同的引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，可獲得豐富的擴(kuò)增譜帶［1］。因此本試驗(yàn)中僅采用了由6條引物組合而成的15對(duì)引物。另外，在RSAP條帶統(tǒng)計(jì)過(guò)程中，本研究只對(duì)條帶的出現(xiàn)與否進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，而未對(duì)條帶的強(qiáng)弱進(jìn)行分析，實(shí)際擴(kuò)增條帶的強(qiáng)弱在一定程度上也能反映DNA水平的變化，如拷貝數(shù)的多少等［16］。而在相關(guān)文獻(xiàn)中，把擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度差異作為區(qū)分不同樣本的報(bào)道并不多見(jiàn)，因此本試驗(yàn)中進(jìn)行RSAP條帶統(tǒng)計(jì)時(shí)，也只將條帶的有無(wú)作為是否多態(tài)性位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。

RSAP結(jié)果分析表明，湛山灣二倍體野生群體與兩個(gè)栽培品系981、07－2，各群體內(nèi)的多態(tài)性比率都非常低，最低的栽培品系981的僅為0.15%，而湛山灣野生群體與栽培品系07－2的都低于1%，比Pang等［17］分析的青島湛山灣二倍體的龍須菜多態(tài)性比率（14.7%）和丁弘葉等［18］研究所得的青島湛山灣二倍體的龍須菜多態(tài)性比率（33.3%）低；同時(shí)各群體的有效等位基因數(shù)也很少，表示群體基因變異程度的Shannon指數(shù)I也非常低，湛山灣野生群體的僅為0.005 1，比Pang等［17］與丁弘葉等［18］的相應(yīng)數(shù)值要低一個(gè)數(shù)量級(jí)甚至更多。以上數(shù)據(jù)都反映出本試驗(yàn)中各群體的基因變異程度非常低，這是由于所采用的分子標(biāo)記技術(shù)RSAP是基于限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的多態(tài)性標(biāo)記，基因發(fā)生突變的概率本身就很低，如果是特定位點(diǎn)的突變頻率會(huì)更低，這就直接導(dǎo)致了在分析同一物種不同群體遺傳多樣性時(shí)會(huì)出現(xiàn)很低的情況。這也說(shuō)明了同一物種的遺傳多樣性檢測(cè)值與所采用的分子標(biāo)記技術(shù)相關(guān)。

另外，群體間的RSAP分析結(jié)果顯示，野生群體與兩個(gè)栽培品系間的基因流為0.015 5，小于1，基因流動(dòng)性很低，表明群體間幾乎不存在基因流動(dòng)。兩兩群體間的基因分化度Gst也均大于0.5接近1，說(shuō)明各群體間的基因分化程度大。各群體間的遺傳距離很小，遺傳相似系數(shù)很大，盡管2個(gè)栽培品系981、07－2間遺傳距離不大，但栽培品系與湛山灣野生群體間的遺傳距離相對(duì)較大，而UPGMA聚類分析也明顯將湛山灣野生群體與栽培品系981、07－2區(qū)分開(kāi)來(lái)，表明野生群體與栽培品系間已產(chǎn)生一定的遺傳隔閡。

本試驗(yàn)中RSAP分析的群體內(nèi)及群體間遺傳多樣性系數(shù)均都很低，也是由于材料本身的原因：龍須菜產(chǎn)生的是不動(dòng)精子，不能進(jìn)行遠(yuǎn)距離受精；湛山灣二倍體野生群體中的個(gè)體均于2010年10月采自青島湛山灣，時(shí)空的一致性導(dǎo)致了所采集個(gè)體幾乎不與外來(lái)個(gè)體間發(fā)生雜交互換，缺乏基因的流動(dòng)；栽培品系981最初是由湛山灣野生個(gè)體通過(guò)人工選擇而來(lái)的，07－2則是在981基礎(chǔ)上進(jìn)一步經(jīng)過(guò)人工誘變選育而來(lái)，在生產(chǎn)實(shí)踐中一直都通過(guò)營(yíng)養(yǎng)繁殖進(jìn)行栽培，造成了龍須菜群體內(nèi)由于缺乏等位基因的互換而遺傳多樣性低。針對(duì)龍須菜遺傳多樣性低的現(xiàn)狀，一方面有必要通過(guò)保護(hù)其特殊生長(zhǎng)環(huán)境保護(hù)龍須菜的野生資源，另一方面加快其遺傳育種進(jìn)度，同時(shí)建立種質(zhì)庫(kù)，進(jìn)而更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有龍須菜種群遺傳資源的保護(hù)。

目前用SCAR標(biāo)記進(jìn)行農(nóng)作物種質(zhì)鑒定在國(guó)際上已普遍展開(kāi)［19］。在國(guó)內(nèi)藻類方面，SCAR標(biāo)記已被廣泛地應(yīng)用于紫菜的種質(zhì)鑒定［20－22］，同時(shí)在龍須菜的種質(zhì)鑒定方面也得到了應(yīng)用［18］。栽培品系981生長(zhǎng)快速，分支多，耐高溫，速生抗逆，瓊膠含量高且好，屬主要的栽培品種，是從青島湛山灣野生種群經(jīng)過(guò)誘變選育而來(lái)［23］，與栽培品系07－2、野生個(gè)體在外觀上沒(méi)有明顯的區(qū)別，但在生長(zhǎng)性狀及生化特性上差異顯著［24］，而長(zhǎng)期以來(lái)并沒(méi)有很好的便捷的手段或方法區(qū)分。本試驗(yàn)中，在對(duì)龍須菜野生種群與栽培品系981、07－2進(jìn)行RSAP遺傳多樣性分析過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)6條栽培品系981的特異條帶，并將其中兩條帶成功轉(zhuǎn)化為981特異的SCAR標(biāo)記。該SCAR標(biāo)記將在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的栽培品系981與其他龍須菜材料區(qū)分，保證栽培苗種的純度，避免使用不合格苗種給龍須菜栽培產(chǎn)業(yè)造成損失，進(jìn)而更有效地進(jìn)行大規(guī)模的人工養(yǎng)殖和滿足科研需要。

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