人乳頭瘤病毒E6／E7mRNA bDNA檢測(cè)在宮頸疾病篩查中的應(yīng)用

王少蕾 王筱紅 羅麗雅 吳開(kāi)鋒 廣東省博羅縣婦幼保健院 516100

婦科常見(jiàn)惡性腫瘤其中之一為宮頸癌，其發(fā)病率較高，為女性腫瘤發(fā)病率的第二位。我國(guó)解放初期，巴氏涂片開(kāi)展普遍，宮頸癌發(fā)病得到較好控制，巴氏涂片在宮頸癌篩查歷史中起到了很大的作用。因近20余年來(lái)對(duì)于宮頸癌篩查不重視，宮頸癌發(fā)病有升高的趨勢(shì)，且農(nóng)村地區(qū)經(jīng)濟(jì)相對(duì)欠發(fā)達(dá)，農(nóng)村發(fā)病率增高趨勢(shì)更加明顯。由于衛(wèi)生知識(shí)等多方面因素，該病在較年輕婦女中發(fā)病亦趨增加，新發(fā)病例仍較高，占全世界發(fā)病率的28%。眾多數(shù)據(jù)表明，導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的主要原因是人乳頭瘤病毒（HPV）感染。眾多流行病學(xué)、分子生物學(xué)等研究結(jié)果表明，宮頸癌的根本致病因素是人乳頭瘤病毒（HPV）感染，HPV有百余種亞型，其中高危型 HPV與宮頸癌的相關(guān)性較高，有證據(jù)表明，其相關(guān)性要高于吸煙與肺癌的相關(guān)性，宮頸癌中95%是由它引起［1］。HPV與宮頸癌的關(guān)系因此受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。在宮頸癌治療方面，宮頸癌的治療效果明顯差于癌前病變。若能早期診斷和治療宮頸癌前病變，患者的生存率及生存質(zhì)量可明顯提高，也可減少宮頸癌的浸潤(rùn)，降低宮頸癌的死亡率。目前國(guó)家重大公共衛(wèi)生項(xiàng)目的兩癌篩查（宮頸癌和乳腺癌）可早期篩查出宮頸癌前病變，以便于早期治療，以達(dá)到上述目的。因此，宮頸癌的防治關(guān)鍵在于篩查出更多的癌前病變，以便于早期治療，婦科普查工作的現(xiàn)實(shí)意義也在于此。目前宮頸癌的篩查方法較多，基于其HPV與宮頸癌的關(guān)系，筆者擬探討基于HPV的檢測(cè)手段來(lái)更好的早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌前病變和宮頸癌。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取我縣所轄鄉(xiāng)鎮(zhèn)2013年1－12月的兩癌篩查農(nóng)村婦女中經(jīng)過(guò)初步篩查懷疑存在宮頸疾病者為研究對(duì)象，年齡30～65歲，平均年齡（40.2±7.3）歲。有子宮切除手術(shù)史或?qū)m頸手術(shù)史，或有盆腔放射治療史的剔除在外，且目前無(wú)妊娠，在取標(biāo)本前無(wú)性生活達(dá)3d以上，亦無(wú)陰道沖洗及放藥。

1.2 方法 對(duì)患者進(jìn)行HPV E6／E7mRNA bDNA檢測(cè)和TCT檢測(cè)，最后均行宮頸病理學(xué)檢查。

1.2.1 HPV E6／E7mRNA bDNA檢測(cè)。（1）儀器和試劑：科蒂亞生物有限公司電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、冷光儀、宮頸高危HPV E6／E7mRNA檢測(cè)試劑盒（即宮頸穩(wěn)態(tài)檢測(cè)試劑盒）。（2）操作方法：用細(xì)胞采樣器的中央刷毛部分輕輕地深插入子宮頸管內(nèi)，按同一個(gè)時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)動(dòng)采樣器5～8周后，將收集的細(xì)胞放入細(xì)胞保存液中。將標(biāo)本移入離心管，3 000r／min離心5min后倒掉上清液，用2ml去離子水（ddH2O）清洗后再次離心，去上清液，達(dá)到標(biāo)本同質(zhì)化的目的。將已處理的有細(xì)胞的離心管中加入裂解混合液（200μl裂解液和400ml ddH2O，混合比例為1∶2），用移液槍吹打細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞分散懸浮，再加入5μl蛋白酶K。放入65℃恒溫箱中放置1h，裂解過(guò)程中進(jìn)行2～3次震蕩，1h后取上清液用于檢測(cè)（附注：多人份時(shí)裂解液的配置可以一次配置多量，按照細(xì)胞裂解液和去離子水1∶2的比例，如92人份：19ml裂解液＋38ml ddH2O。混勻后分別取600μl到標(biāo)本中，切記蛋白酶K不能混合入上述稀釋的裂解液中，每個(gè)標(biāo)本單獨(dú)加入固定的5μl）；從已制備好的標(biāo)本裂解液中取出實(shí)驗(yàn)所需量。1例患者取50μl裂解后的標(biāo)本用于檢測(cè)。檢測(cè)緩沖液配置→布板→信號(hào)放大→讀板。從4℃冰箱取出底物復(fù)溫。復(fù)溫后加入底物催化劑31.5μl，手搖混勻。將雜交板從溫箱中取出，掀開(kāi)封板貼紙，用1×洗脫液200μl洗板洗3次。將所配底物每孔加入100μl，放入46℃溫箱保溫20min后取出，上科蒂亞冷光儀檢測(cè)。將所讀數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)入數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行電腦計(jì)算，結(jié)果將顯示定性結(jié)果。

1.2.2 研究對(duì)象進(jìn)行TCT檢測(cè)。（1）使用TCT專(zhuān)門(mén)的采樣器來(lái)采集子宮頸細(xì)胞樣本；（2）獲得脫落細(xì)胞后浸入液基細(xì)胞處理試劑中進(jìn)行處理；（3）將有效細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，通過(guò)過(guò)濾離心方法清除黏液對(duì)制片的干擾，制成脫落細(xì)胞薄片；（4）用HE染色、巴氏染色或其他免疫組織化學(xué)染色等方法使細(xì)胞著色；（5）在顯微鏡下通過(guò)人工觀察分析來(lái)檢查陰道或?qū)m頸的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 研究對(duì)象進(jìn)行病理學(xué)檢查。在陰道鏡下直接活檢取材，取材后用福爾馬林液固定后送廣東省婦幼保健院病理科檢測(cè)，得出病理學(xué)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用sigmastat3.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不同程度宮頸病變中兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率比較采用χ2檢驗(yàn)。以病理檢查結(jié)果為參照分為正常組、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌共五組，對(duì)比 HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT兩種檢測(cè)方法在該五組中的準(zhǔn)確度及假陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

不同人群HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT檢測(cè)結(jié)果的比較，見(jiàn)表1。

表1 不同人群HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT檢測(cè)結(jié)果的比較〔n（%）〕

本文對(duì)象共223例為可疑宮頸疾病患者，以最終病理學(xué)結(jié)果對(duì)其分為正常、CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌共五組，對(duì)該五組患者的HPV E6／E7mRNA bDNA、TCT檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)正常組中HPV E6／E7mRNA bDNA假陽(yáng)性率為46.9%（15／32），明 顯低于 TCT 的假 陽(yáng)性率62.5%（20／32），P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌組的HPV E6／E7mRNA bDNA的陽(yáng)性率均明顯高于TCT組，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

HPV是DNA病毒的一種，其DNA分為3個(gè)部分，檢測(cè)主要是早期基因區(qū)（E）。早期基因蛋白分為E1、E2、E4、E5、E6、E7等，其功能有病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化復(fù)制，而主要的致癌基因?yàn)镋6、E7。

HPV型別較多，有高危型、低危型，目前已發(fā)現(xiàn)的有百余種亞型，其中生殖道感染有近30種亞型，部分涉及腫瘤的發(fā)生。其中與子宮頸腫瘤有關(guān)的型常常是高危型HPV，低危與高危HPV分型與病毒導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)有關(guān)。其中低危型HPV感染是導(dǎo)致生殖道疣的主要原因。而高危型常引起宮頸癌及子宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）［2］，最常見(jiàn)的HPV分型是16、18亞型。有研究表明，地域性差異是HPV感染亞型分布的一個(gè)特點(diǎn)，如西方國(guó)家及非洲國(guó)家，16、18、58和52型引起的宮頸癌所占比例低于亞洲國(guó)家［3］。

宮頸黏膜屬鱗狀上皮組織，是HPV易感部位。宮頸細(xì)胞中的HPV DNA有兩種存在狀態(tài)：整合和游離狀態(tài)。病毒存在的狀態(tài)決定了宮頸病變的程度，DNA處于游離狀態(tài)一般為癌前病變期，當(dāng)DNA病毒與宿主細(xì)胞的染色體整合時(shí)，表明已進(jìn)入癌癥進(jìn)展期。E6、E7基因有負(fù)相調(diào)節(jié)作用。因E2為結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)，導(dǎo)致HPV E6、E7基因負(fù)相調(diào)節(jié)作用消失，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入調(diào)控失常期，E6、E7基因發(fā)生表達(dá)異常。而HPV E6和E7蛋白在病毒復(fù)制中起到至關(guān)重要的作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的無(wú)限增殖和惡性轉(zhuǎn)化［4］。p53Rb蛋白是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，當(dāng)與E6、E7蛋白結(jié)合，就起到致癌的作用了。p53是腫瘤抑制的重要蛋白，是細(xì)胞生長(zhǎng)周期中的負(fù)調(diào)控。當(dāng)其基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，會(huì)促進(jìn)靶基因p21合成大幅度提高，抑制細(xì)胞增殖，這時(shí)宿主細(xì)胞DNA發(fā)生損傷。E6蛋白與細(xì)胞內(nèi)E6－AP結(jié)合，再與p53特異性地結(jié)合在一起，進(jìn)而水解，使其喪失了細(xì)胞生長(zhǎng)負(fù)調(diào)節(jié)功能，從而引起細(xì)胞無(wú)限增生并向惡性轉(zhuǎn)化［4，5］。有文獻(xiàn)表明E6不僅和上述蛋白相互作用，同時(shí)還與靶蛋白1、p21、干擾素調(diào)控因子3相互作用，同時(shí)也參與細(xì)胞凋亡。E7蛋白轉(zhuǎn)化蛋白，與腫瘤抑制蛋白視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）親和力很高，Rb與E7結(jié)合使Rb－E2F復(fù)合物解離，游離出E2F，使轉(zhuǎn)錄因子立即發(fā)揮作用，細(xì)胞周期失控而發(fā)生永生化［4］。同時(shí)，E7還可以使得突變?cè)黾?。這就是HPV致癌的機(jī)理。

在臨床治療來(lái)說(shuō)，與宮頸癌前病變和微小浸潤(rùn)癌相比較，宮頸浸潤(rùn)癌治療的難度遠(yuǎn)比癌前病變困難，部分患者的生活質(zhì)量較差。宮頸癌是一種感染性癌癥，如果通過(guò)選擇一種好的篩查方法，及時(shí)發(fā)現(xiàn)癌前病變，可以高效阻斷宮頸癌的發(fā)生。或發(fā)現(xiàn)微小浸潤(rùn)癌，也可以有效提高宮頸疾病患者的生存率和生存質(zhì)量，這正是筆者尋找宮頸癌篩查手段的意義所在。

目前，宮頸癌的篩查已經(jīng)作為我國(guó)重大公共衛(wèi)生項(xiàng)目，開(kāi)展較普及，因?yàn)槌杀締?wèn)題，初步篩查的主要手段是巴氏涂片法，以TBS報(bào)告形式，或液基細(xì)胞學(xué)（TCT）檢測(cè)，部分經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，采用HPV檢測(cè)進(jìn)行篩查，或者高危人群采取HPV檢測(cè)，有學(xué)者也提出液基細(xì)胞學(xué)與HPV同時(shí)檢測(cè)，但篩查費(fèi)用較高，不適宜普及。宮頸癌篩查的方法還有陰道鏡檢查、組織病理學(xué)檢查、血清學(xué)方法等［6］，損傷性、準(zhǔn)確度太低、假陰性率高等都是上述方法的缺點(diǎn)。故此要尋找更好的辦法以提高準(zhǔn)確性?？茖W(xué)尋找宮頸癌篩查手段，以便于早期進(jìn)行監(jiān)測(cè)和干預(yù)，同時(shí)進(jìn)行早期治療，這對(duì)于降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有不可估量的意義。

目前檢測(cè)HPV－DNA的方法有，（1）聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)：通用引物PCR；間接原位PCR；熒光定量PCR；實(shí)時(shí)PCR；PCR－ELISA檢測(cè)，直接原位PCR；PCR結(jié)合雙向點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)，單管巢式PCR；競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR。（2）核酸雜交技術(shù)：斑點(diǎn)雜交法、80uthern雜交法、熒光原位雜交法等。（3）雜交捕獲技術(shù)。（4）SP法染色檢測(cè) HPV早期蛋白E6［6，7］等基因芯片技術(shù)。這些方法具有各自的缺點(diǎn)，如標(biāo)本的要求高，操作過(guò)程繁雜，且標(biāo)本容易污染、假陽(yáng)性較高；大規(guī)模應(yīng)用于臨床，價(jià)格昂貴。綜上所述，為了提高特異性、降低假陽(yáng)性率、提高準(zhǔn)確率，又能夠大規(guī)模用于篩查，兼顧價(jià)格的合理性，筆者必須尋找新的檢測(cè)方法。

已經(jīng)知道宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的主要原因是致癌蛋白HPV E6／E7整合入宿主的基因組，導(dǎo)致E6／E7mRNA的表達(dá)失控，引起惡性轉(zhuǎn)化，檢測(cè)這種致癌基因的轉(zhuǎn)錄具有不必重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)即能鑒定高危反復(fù)感染者的潛力［8］。在宮頸疾病的早期篩查中價(jià)值明顯增高。

E6／E7存在于HPV中，是癌基因的片段。而導(dǎo)致宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的是病毒癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA［9］；宿主細(xì)胞本身不發(fā)生癌變的前提是癌基因不表達(dá)；宮頸上皮組織中具有癌基因活性的是HPV E6／E7mRNA；E6／E7可抑癌基因p53和Rb的降解，從而干擾細(xì)胞周期調(diào)節(jié)［10］；癌變水平與HPV E6／E7mRNA表達(dá)的多少成正比例關(guān)系。因此要對(duì)感染HPV高危型的婦女進(jìn)行宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估選用宮頸細(xì)胞中HPV E6／E7mRNA的檢測(cè)更具意義。bDNA技術(shù)原理是基于“三明治”核酸雜交技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)優(yōu)勢(shì)：（1）擴(kuò)增特點(diǎn)及擴(kuò)增過(guò)程不是呈指數(shù)增長(zhǎng)，從而穩(wěn)定性高；（2）具有確定的放大倍數(shù)，重復(fù)性亦較高；（3）能精確的檢測(cè)mRNA數(shù)量；（4）能監(jiān)測(cè)其動(dòng)態(tài)水平。傳統(tǒng)技術(shù)中的不確定因素、過(guò)程復(fù)雜及種種缺陷在該方法中都被克服。直接用特定裂解液將樣本裂解后，經(jīng)探針雜交與信號(hào)放大即可得到結(jié)果，具有快速性及更高的精確度等優(yōu)點(diǎn)。

本文表明HPV E6／E7mRNA bDNA在宮頸癌篩查中假陽(yáng)性率明顯低于TCT的假陽(yáng)性率，而CIN1、CIN2、CIN3、宮頸癌組的HPV E6／E7mRNA bDNA的陽(yáng)性率均明顯高于TCT組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故此，人乳頭瘤病毒E6／E7 mRNA bDNA檢測(cè)是目前宮頸癌篩查中較好的方法，具有較好的準(zhǔn)確度，假陽(yáng)性率亦低，可能更能評(píng)估宮頸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

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