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    冰溫保存腎表皮細(xì)胞及其滲透特性的實驗研究

    2014-10-11 06:33:00梁飛諸凱王雅博
    化工進(jìn)展 2014年3期
    關(guān)鍵詞:二甲基亞砜冰溫保護(hù)劑

    梁飛,諸凱,2,王雅博

    (1天津商業(yè)大學(xué)天津市制冷技術(shù)重點實驗室,天津300134;2天津大學(xué)中低溫?zé)崮芨咝Ю媒逃恐攸c實驗室,天津300072)

    冰溫保存技術(shù)[1-2]是一種新的生物低溫保存方法。冰溫是指從0 ℃開始到生物組織凍結(jié)溫度(即冰點)為止的溫度區(qū)域,在這個溫度范圍內(nèi)保存細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)外都不產(chǎn)生冰晶[3-4]。與目前臨床醫(yī)學(xué)廣泛使用的生物冷凍保存方法相比,避開了冰晶對細(xì)胞造成傷害,而且有助于細(xì)胞機(jī)能的快速恢復(fù)。研究表明,當(dāng)降溫速率小到一定數(shù)值時[5],細(xì)胞內(nèi)的水分有足夠的時間能從細(xì)胞內(nèi)滲透出來,從而降低胞內(nèi)自由水含量,通過這種方法可以很好的抑制胞內(nèi)冰的產(chǎn)生,對細(xì)胞的低溫保存有促進(jìn)作用[6-7]。

    通常情況下,細(xì)胞保存前都會添加低溫保護(hù)劑(cryoprotective agent,CPA),以有效的降低細(xì)胞冰點[8-10]。在加入一定濃度的CPA后,細(xì)胞膜內(nèi)外會出現(xiàn)滲透壓不平衡,導(dǎo)致水和CPA同時通過細(xì)胞膜進(jìn)出細(xì)胞,細(xì)胞體積也隨之改變,當(dāng)細(xì)胞體積變化超越細(xì)胞膜所能承受范圍,將會對細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷,即滲透損傷。決定細(xì)胞形態(tài)變化的參數(shù)[11-12]主要有兩個,細(xì)胞膜水滲透系數(shù)(Lp)和細(xì)胞膜 CPA的滲透系數(shù)(Ps)。對這兩個參數(shù)的研究有助于冰溫保存細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展。

    細(xì)胞膜對水分的滲透特性可以通過細(xì)胞體積隨外界環(huán)境(滲透壓)的變化來反映。研究表明,細(xì)胞膜腎表皮細(xì)胞的相變溫度在?5~?8 ℃,研究細(xì)胞冰溫保存過程,就應(yīng)在0 ℃附近溫度范圍中測定細(xì)胞膜的滲透特性。眾多研究者利用多種方法對細(xì)胞膜的滲透特性進(jìn)行了研究。Chen等[13]利用微型灌注設(shè)備,研究了鼠樹突細(xì)胞在二甲基亞砜溶液中的滲透系數(shù),得到了 22 ℃下水的滲透系數(shù)為 0.17 μm/(atm·min),CPA的滲透系數(shù)為0.63×10?3cm/min。Wang等[14]測量了4 ℃時牛卵母細(xì)胞在胚泡期和四分體時期的滲透參數(shù),分別為0.08 um/(atm·min)、0.0011 cm/min 和 0.14 um/(atm·min)、0.0029 cm/min。Liu等[15]測量了常溫時兔卵母細(xì)胞在二甲基亞砜、乙二醇和甘油溶液中的滲透參數(shù)。

    本研究選取了–4 ℃為冰溫保存溫度,選?。ìF(xiàn)行臨床使用的)4 ℃和0 ℃為對照實驗,并稱其為常溫保存溫度。主要研究內(nèi)容是通過實驗的方法測量腎臟表皮細(xì)胞的滲透特性,主要有細(xì)胞的等滲體積(Viso)、非滲透體積(Vb)、細(xì)胞膜對水的滲透系數(shù)(Lp)及其活化能(Ea),細(xì)胞膜對CPA的滲透系數(shù)(Ps)及其活化能(Ea),并且對細(xì)胞進(jìn)行長時間保存,對比細(xì)胞的存活率,找出最優(yōu)保存溫度。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器及實驗材料

    儀器:光學(xué)顯微鏡,Olympus BX-51,日本;冷熱臺及控制系統(tǒng),Linkam THMS600,英國;CCD圖像采集裝置;細(xì)胞培養(yǎng)箱;安全柜;Innovatis CASY?TT,Roche,瑞士。

    實驗材料:DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、雙抗、臺盼蘭染色劑、磷酸鹽緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙三醇(GLY)。

    實驗所用細(xì)胞為 293T細(xì)胞,將細(xì)胞放入完全培養(yǎng)基(90%DMEM培養(yǎng)基、10%小牛血清、1%雙抗——除特殊說明,本文所提到的百分比均為體積分?jǐn)?shù))中生長,配置好后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)箱中保持溫度37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境。待細(xì)胞培養(yǎng)成熟后,將培養(yǎng)皿取出,在安全柜中操作將培養(yǎng)液吸入離心管,以800 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,然后利用血球計數(shù)板配置出4×105/mL細(xì)胞懸液。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 圖像采集

    細(xì)胞的精確控制溫度通過一套冷熱臺及其控制系統(tǒng)實現(xiàn),如圖1所示。左側(cè)a部分是該系統(tǒng)的控制部分,由冷熱臺(BCS-196)、CCD 圖像數(shù)字采集系統(tǒng)、溫度控制臺(Linksys32)和PC端成像軟件組成。樣品池放置在顯微鏡(Olympas BX51)載物臺上,可實現(xiàn)在–196~125 ℃范圍內(nèi)降溫和加熱,還可以實現(xiàn)以0.1~150 ℃/min的降溫/升溫速率精確控溫。該冷臺通過液氮流進(jìn)行降溫,通過電加熱進(jìn)行加熱,并且通過鉑電阻熱電偶對其溫度進(jìn)行監(jiān)測[16]。

    圖1 冷熱臺及其控溫系統(tǒng)和細(xì)胞滲透原理圖

    圖1右側(cè)b部分是細(xì)胞滲透原理的示意圖,為更清楚表達(dá)實驗過程,將該部分的圖形比例擴(kuò)大表示,尤其是細(xì)胞的尺寸。如圖所示,載玻片和蓋玻片之間充滿細(xì)胞懸液,由于液體表面張力的作用,是兩玻片緊緊吸附,保證了玻片之間是單層細(xì)胞。高濃度的灌注液(冷凍保護(hù)液或 NaCl 溶液)從左側(cè)導(dǎo)入,灌注溶液的濃度高于細(xì)胞培養(yǎng)液的濃度,其濃度差是驅(qū)動灌注液從左向右流動的動力,兩者混合后從右側(cè)流出平,最終細(xì)胞周圍溶液的濃度會達(dá)到灌注液的濃度,細(xì)胞在此過程中,形態(tài)會產(chǎn)生變化,通過正上方的鏡頭傳入a部分的計算機(jī)成像軟件[17-18]。

    1.2.2 圖像處理方法

    本研究通過顯微鏡觀察法測量細(xì)胞的體積,假設(shè)細(xì)胞為理想球體模型,通過上述系統(tǒng)可得到實驗過程中的細(xì)胞圖片,通過測量細(xì)胞的二維投影面積,再經(jīng)過計算可以推斷細(xì)胞的體積。Image-Pro plus圖像分析軟件將細(xì)胞圖片處理成灰度不同的像素點,在500倍鏡下,每個像素點對應(yīng)的面積為0.138 μm×0.138 μm,通過對像素點計數(shù),可得到細(xì)胞的實際面積。每次選取3~5個細(xì)胞,測量3次,求平均值。低溫顯微鏡得到的二維投影面積與體積的關(guān)系如式(1)。

    1.2.3 細(xì)胞非滲透體積Vb的計算

    將滲透壓濃度為118 Osmoles/kg、185 Osmoles/kg、260 Osmoles/kg、302 Osmoles/kg、670 Osmoles/kg、863 Osmoles/kg、1349 Osmoles/kg、1583 Osmoles/kg、1741 Osmoles/kg、2252 Osmoles/kg、2682 Osmoles/kg、2800 Osmoles/kg、3186 Osmoles/kg 的 NaCl溶液,按上述方法進(jìn)行細(xì)胞滲透試驗。細(xì)胞分別會對以上溶液呈現(xiàn)出不同的相應(yīng),最終細(xì)胞的內(nèi)外溶液會達(dá)到滲透平衡,細(xì)胞體積的變化過程由圖像采集系統(tǒng)記錄下來,其最終的平衡體積Veq可以表述為Boyle van’t Hoff關(guān)系式[19],如式(2)。

    式中,Viso為細(xì)胞在等滲溶液中(即滲透壓為Miso,mmol/kg)的體積,一般取細(xì)胞的初始體積,μm3;Veq為細(xì)胞在滲透壓為M的溶液中的平衡體積,μm3;Vb為細(xì)胞的非等滲體積,μm3。

    從式(2)可以看出,細(xì)胞的相對體積Veq/Viso與溶液的相對滲透壓M/Miso的倒數(shù)呈線性關(guān)系,將實驗數(shù)據(jù)作圖并進(jìn)行線性擬合,可以得到直線在y軸的截距即為細(xì)胞的非滲透體積比Vb/Viso。

    1.2.4 細(xì)胞膜滲透參數(shù)(Lp、Ps)的測定

    當(dāng)溶液中只有非滲透性溶質(zhì)(如NaCl)存在時,水的滲透系數(shù)可以利用一個描述水分傳輸率的微分方程得到,如式(3)。

    在有可滲透性溶質(zhì)(CPA)、不可滲透性溶質(zhì)(NaCl)和溶劑(H2O)共存的三元溶液中,水的傳輸和CPA的滲透同時存在并且相互影響,可采用兩參數(shù)模型(The two-parameter model)[20-21]來描述作為細(xì)細(xì)胞膜傳輸動力模型,模型由一對耦合的微分方程組成,式(4)表示細(xì)胞體積隨時間的變化,式(5)表示胞內(nèi)可滲透性溶質(zhì)(CPA)的物質(zhì)的量隨時間的變化。

    其中,Vs(t)與Ns(t)的關(guān)系如式(6)。

    Lp、Ps的值可以通過將高滲CPA溶液灌注入細(xì)胞懸液后所獲取的細(xì)胞體積變化數(shù)據(jù)進(jìn)行最小二乘曲線擬合得到。

    1.2.5 活化能Ea的計算

    通過上面分析,Lp、Ps可以通過分析實驗數(shù)據(jù)得到,同時,Lp、Ps所對應(yīng)的活化能可以用阿倫尼烏斯關(guān)系式[22][式(7)]表示。

    式中,P為細(xì)胞膜的滲透參數(shù)(Lp或Ps);P0為在參照溫度下的值。

    對式(7)取自然對數(shù),整理得式(3)。

    由此可知,ln(P)是關(guān)于1/T的方程,將計算值與溫度值做線性擬合,其斜率為?Ea/R,由此可以得到活化能的值。

    1.2.6 細(xì)胞存活率實驗

    為了研究冰溫保存細(xì)胞的效果,將不同的冷凍保護(hù)劑加入細(xì)胞懸液中,放入冰溫庫進(jìn)行長時間保存,利用細(xì)胞計數(shù)分析儀 Innovatis CASY?TT(Roche)檢驗細(xì)胞的存活率。

    將細(xì)胞濃度為 4×105/mL的細(xì)胞懸液配置好之后,分別進(jìn)行以下兩組實驗:①向細(xì)胞懸液加入15%的DMSO試劑,分別放入不同的環(huán)境溫度中(4 ℃、0 ℃、–4 ℃),每12 h記錄一次存活率,到48 h為止。②向細(xì)胞懸液中分別加入15%不同種類的低溫保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甘油(GLY),并放置于–4 ℃的環(huán)境溫度中,每12 h記錄一次存活率,到48 h為止。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 細(xì)胞非滲透體積的測量

    當(dāng)細(xì)胞在高滲溶液中時,細(xì)胞內(nèi)水分外流,體積發(fā)生皺縮,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓相等時,細(xì)胞體積達(dá)到滲透平衡。在常溫下,記錄細(xì)胞在不同滲透壓NaCl溶液內(nèi)的滲透平衡過程的圖像,利用上述圖像處理方法對不同滲透壓下的平衡體積進(jìn)行處理。首先,測量細(xì)胞在等滲溶液中的體積,通過多次觀察統(tǒng)計,腎表皮細(xì)胞的平均等滲體Viso=2472.58 μm3。然后,測定細(xì)胞在不同滲透環(huán)境中平衡后的體積數(shù)據(jù),得到腎表皮細(xì)胞隨滲透壓變化規(guī)律,如圖2所示,并進(jìn)行最小二乘法線性擬合,得到Boyle van’t Hoff曲線,并且外延該直線至無限大濃度,即圖2中y軸截距位置,可以得到細(xì)胞的非滲透體積Vb=0.22Viso,即Vb=543.9676 μm3,其擬合系數(shù)r2=0.96175。

    2.2 細(xì)胞滲透系數(shù)的測量

    細(xì)胞在高滲的 NaCl溶液中,在胞內(nèi)外滲透壓差的作用下,水分會通過細(xì)胞膜流出細(xì)胞。而 Na離子進(jìn)出細(xì)胞需要消耗能量,它對細(xì)胞膜來說是一種非滲透性溶質(zhì),因此只有水分子通過細(xì)胞膜,如圖3所示,在75 s以后,細(xì)胞體積下降到0.45Vb左右保持滲透平衡,在一定范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。這說明在整個滲透過程中只有水分進(jìn)出,而 Na離子未轉(zhuǎn)移。將細(xì)胞變化圖片在軟件中進(jìn)行處理,得到細(xì)胞體積隨時間變化的數(shù)據(jù),利用Matlab(MathWorks,美國)軟件進(jìn)行處理,根據(jù)式(3)采用Levenberg-Marquard法進(jìn)行曲線擬合,可得到水的滲透系數(shù)Lp,如表1列出了3種低溫保護(hù)劑在不同溫度時的滲透參數(shù)值。

    圖2 腎表皮細(xì)胞的Boyle van’t Hoff關(guān)系曲線

    圖3 細(xì)胞在NaCl溶液中時體積隨時間的變化曲線

    圖4左圖顯示的是初始時刻,0 ℃時細(xì)胞在15%的二甲基亞砜溶液中的圖像,右圖顯示的是左圖方框中細(xì)胞在0~300 s內(nèi),各個時間點的體積變化圖像,通過Image-Pro plus軟件處理可得到細(xì)胞體積的數(shù)據(jù)。通過數(shù)據(jù)可以得到細(xì)胞在二甲基亞砜溶液中的體積變化曲線,如圖5和圖6所示。在50 s附近時,細(xì)胞體積降到最小值,在以后的時間內(nèi),細(xì)胞體積逐漸上升,該圖與圖3相比有很大區(qū)別。很顯然在50 s前,細(xì)胞外溶液滲透壓大于胞內(nèi),水分從細(xì)胞內(nèi)流出,細(xì)胞體積急劇減小,在50 s左右達(dá)到平衡;在50 s之后,隨著二甲基亞砜分子逐漸進(jìn)入細(xì)胞,水分重新回到了細(xì)胞內(nèi),因此細(xì)胞體積有所回升。將細(xì)胞體積變化數(shù)據(jù),根據(jù)式(4)~式(6)利用 Levenberg–Marquard方法進(jìn)行曲線擬合,可得到水的滲透系數(shù)Lp和DMSO的滲透系數(shù)Ps,數(shù)據(jù)見表1。

    表1 腎細(xì)胞在不同低溫保護(hù)劑中的滲透參數(shù)

    圖4 15%的DMSO溶液中細(xì)胞圖像

    圖6 –4 ℃時細(xì)胞體積變化曲線

    圖5是在0 ℃、4 ℃和–4 ℃下,細(xì)胞在15%的二甲基亞砜溶液中的體積變化曲線。觀察可知,細(xì)胞體積變化趨勢一致,都是細(xì)胞體積先急劇減小,然后逐漸變大。但是,在同一時間點上溫度越低,細(xì)胞體積越大。同時,隨溫度的降低,細(xì)胞皺縮到最小體積的時間越長,這個最小體積也隨溫度的降低而增大。這是由于溫度對低溫保護(hù)劑的滲透系數(shù)影響所造成的,觀察表1的數(shù)據(jù)可知,二甲基亞砜的Lp和Ps值均隨溫度的下降而減小,說明水和二甲基亞砜的滲透能力均隨溫度的下降而降低,尤其是在–4 ℃時,Lp和Ps值均比零上溫度低一個數(shù)量級,這正說明了滲透參數(shù)受溫度影響嚴(yán)重。

    圖6是細(xì)胞在二甲基亞砜、乙二醇和甘油溶液中的體積變化曲線,觀察曲線可知,三者曲線變化趨勢一致,在同一時間點上,甘油的體積最大,二甲基亞砜和乙二醇的體積相差不大。甘油的曲線下降的最慢,最小體積也是三者中最大的,二甲基亞砜和乙二醇的曲線比較相似,根據(jù)表1數(shù)據(jù)可知,二甲基亞砜和乙二醇在各個溫度的滲透參數(shù)都比較接近,而甘油的滲透參數(shù)小于上述兩者,可見甘油的滲透能力最下小。

    2.3 滲透系數(shù)所對應(yīng)的活化能

    圖7顯示的是細(xì)胞在二甲基亞砜溶液中測得的水的滲透系數(shù)Lp與絕對溫度T的倒數(shù)關(guān)系圖,對其進(jìn)行最小二乘法線性擬合,根據(jù)式(8)可以計算得到細(xì)胞對水的活化能。利用同樣方法可得到其他CPA中活化能的數(shù)據(jù),見表2。

    2.4 細(xì)胞的存活率

    在經(jīng)過冰溫保存過程中,細(xì)胞的質(zhì)量會隨著時間逐漸下降,細(xì)胞活性逐漸降低,直至變?yōu)樗兰?xì)胞,一般認(rèn)為,當(dāng)活細(xì)胞的存活率下降到50%以下時,生存環(huán)境惡化,組織將壞死。

    圖7 腎細(xì)胞對水的滲透系數(shù)的阿侖尼烏斯圖

    表2 腎細(xì)胞的活化能

    圖8 不同溫度下腎細(xì)胞存活率曲線

    通過上述方法,利用細(xì)胞計數(shù)分析儀Innovatis CASY?TT對冰溫保存的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)測量,得到細(xì)胞存活率數(shù)據(jù)。由圖8可見,細(xì)胞在36 h之前,曲線小幅度平穩(wěn)下降,說明細(xì)胞在這段時間沒有經(jīng)歷太大變化,依舊保持活性;在36 h之后, 曲線出現(xiàn)大幅下降,說明細(xì)胞開始出現(xiàn)大量的壞死,在達(dá)到72 h的時候,存活率均低于50%,已經(jīng)不能在進(jìn)行培養(yǎng)。觀察可知,0 ℃曲線在各個時間點基本都高于其他曲線,?4 ℃曲線的次之,4 ℃曲線最低,這說明相對其他兩個溫度來說,0 ℃的環(huán)境對細(xì)胞保存最有益,最佳保存溫度在0~?4 ℃之間。圖9顯示了0 ℃時細(xì)胞在3種低溫保護(hù)劑中保存后存活率的曲線,其變化趨勢與圖8的趨勢相似,同樣說明在36 h之前,細(xì)胞生長良好,能保持很高的活性,在36 h之后,細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死。同時,3種冷凍保護(hù)劑中,甘油的曲線高于其他兩曲線,在36 h之前,二甲基亞砜的曲線和甘油的曲線非常相似,乙二醇的曲線最低,這說明針對腎臟表皮細(xì)胞而言,3種低溫保護(hù)劑對甘油和二甲基亞砜的保護(hù)作用較好,乙二醇相對較差。

    3 結(jié) 論

    本文利用顯微數(shù)字圖像采集系統(tǒng),在冰溫溫度和常溫溫度下,對腎臟表皮細(xì)胞的滲透過程進(jìn)行了研究。觀察了細(xì)胞在非等滲環(huán)境中的滲透響應(yīng),得到了細(xì)胞的等滲體積Viso=2472.58 μm3,非滲透體積Vb=543.9676 μm3。并且根據(jù)細(xì)胞在CPA溶液中的滲透過程,得出了細(xì)胞膜對水的滲透系數(shù)(Lp)及細(xì)胞膜對 CPA的滲透系數(shù)(Ps)。最后進(jìn)行保存,利用細(xì)胞計數(shù)分析儀測量了細(xì)胞存活率隨時間變化趨勢。得出如下結(jié)論。

    圖9 0 ℃時不同保護(hù)劑中細(xì)胞存活率曲線

    (1)通過對比低溫保護(hù)劑在不同溫度下滲透系數(shù)的數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)滲透系數(shù)受溫度影響較大,隨著溫度的減小,滲透系數(shù)逐漸小,其滲透能力也相應(yīng)降低,即細(xì)胞在冰溫環(huán)境下的滲透系數(shù)低于常溫下的滲透系數(shù)。

    (2)通過觀察細(xì)胞在不同溫度下的保存狀況,發(fā)現(xiàn)腎表皮細(xì)胞的最佳保存溫度范圍在 0~?4 ℃之間,即細(xì)胞的冰溫保存效果比現(xiàn)行臨床常用的4~0 ℃范圍的保存效果更好。同時根據(jù)實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),即使在精確控溫的冰溫庫中保存的細(xì)胞,保存時間不宜超過36 h,超過以后細(xì)胞質(zhì)量急劇下降,影響細(xì)胞功能。因此在實際臨床應(yīng)用上,保存時間更不宜超過24 h為好。

    (3)通過觀察細(xì)胞在不同類型低溫保護(hù)劑中的保存情況,發(fā)現(xiàn)在36 h內(nèi),甘油、二甲基亞砜、乙二醇3種低溫保護(hù)劑的保存效果,依次降低,但是三者的保存效果相差不大。

    符 號 說 明

    A——細(xì)胞投影面積,μm2

    Ea——活化能,kcal/mol

    Lp——水對細(xì)胞膜的滲透系數(shù),μm/(atm·min)

    M——摩爾滲透壓濃度,Osmoles/kg

    m——質(zhì)量摩爾濃度,mol/kg

    N——物質(zhì)的量,mol

    Ps——CPA對細(xì)胞膜的滲透系數(shù),cm/min

    R——氣體常數(shù),kcal/(mol·K)

    T——絕對溫度,K

    t——時間,s

    V——細(xì)胞體積,μm3

    Vb——非滲透體積,μm3

    下角標(biāo)

    c——總數(shù)

    w——水

    s——分滲透性溶質(zhì)

    n——滲非透性溶質(zhì)

    o——初始值

    上角標(biāo)

    e——細(xì)胞外

    i ——細(xì)胞內(nèi)

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