酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器的制備及性能

陳丹，連惠婷，孫向英，劉斌

（華僑大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，福建 廈門361021）

酪氨酸（Tyr）是腎上腺激素、去甲腎上腺激素和多巴胺等用于調(diào)節(jié)情緒的生物信號(hào)分子的重要母體之一.如果人體缺乏酪氨酸，就會(huì)出現(xiàn)代謝異常、智力低下、抑郁等疾?。?-2］，而過量酪氨酸攝入則會(huì)使姊妹染色單體發(fā)生改變［3］.因此，建立準(zhǔn)確、靈敏測(cè)定酪氨酸的方法具有重要意義.檢測(cè)酪氨酸的方法主要有高效液相色譜法［4］、毛細(xì)管電泳法［5］、氣相色譜法［6］、紫外可見吸光光度法［7］、熒光光度法［8-9］等.酪氨酸具有電活性，靈敏快速的電化學(xué)傳感器法也常用于酪氨酸的檢測(cè)［10-15］.這些方法雖然展現(xiàn)出較高的靈敏度及較好的選擇性，但在對(duì)實(shí)際樣品中酪氨酸的準(zhǔn)確快速檢測(cè)仍存在局限.分子印跡電化學(xué)傳感器（MIECS）因兼具分子印跡技術(shù)（MIT）對(duì)目標(biāo)分子的特異識(shí)別性［16-19］和電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，即高選擇性、高靈敏度、低成本、易于微型化和自動(dòng)化［20-21］，有望改善其他方法的不足之處，實(shí)現(xiàn)酪氨酸的便攜、快速、準(zhǔn)確測(cè)定.基于此，本文結(jié)合電化學(xué)的高靈敏度優(yōu)勢(shì)和分子印跡技術(shù)的高選擇性特點(diǎn)，采用恒電位沉積得到復(fù)合物膜電極，選用適宜的洗脫劑洗脫去模板分子得到酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器，并優(yōu)化其電沉積時(shí)間、洗脫劑、洗脫時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

1）儀器.CHI660D型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；三電極系統(tǒng)：玻碳電極及其修飾膜電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極（SCE）為參比電極；S-4800型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；PARSTAT2273型高級(jí)電化學(xué)工作站，美國(guó)Princeton Applied Research公司.

2）試劑.殼聚糖（CTS），AR級(jí)，德國(guó)Sigma Aldrich；DL-絲氨酸（DL-Ser），BR級(jí)，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司；L-酪氨酸（L-Tyr）、L-苯丙氨酸（L-phe）、L-色氨酸（L-Trp）、多巴胺（DA）、抗壞血酸（AA）、尿酸（UA），均為BR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；人血清（Human serum），華僑大學(xué)校醫(yī)院提供；實(shí)驗(yàn)用水均為Milli-Q系統(tǒng)提供的超純水，美國(guó)Millipore公司，18MΩ·cm.

1.2 酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器的制作方法

將0.350 0g CTS溶解于稀HCl中，以NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.7，配制成7.0g·L-1CTS溶液.將0.018 2gL-Tyr溶解于HCl溶液中，配制成0.01mol·L-1L-Tyr溶液.取2.00mLL-Tyr與8.00mL CTS攪拌混勻，配制成含0.02mol·L-1L-Tyr，5.6g·L-1CTS的混合電沉積底液，置于4℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?圓盤玻碳電極依次用不同粒徑Al2O3泥漿仔細(xì)打磨拋光，再依次經(jīng)1∶1 HNO3、二次蒸餾水超聲清洗各3～5min至電極表面呈疏水鏡面，室溫下自然晾干.將以玻碳電極為工作電極的三電極系統(tǒng)移入上述配制的酪氨酸殼聚糖混合電沉積底液中，在-1.1V（vs.SCE）恒電位下沉積一定時(shí)間后，取出工作電極，并用少量二次蒸餾水淋洗后晾干，即制備出殼聚糖-酪氨酸聚合膜修飾電極.將電極置于0.01mol·L-1NaOH和無水乙醇的混合溶液中，施加+1.0V電壓以洗脫去模板分子，制備成保留有酪氨酸分子空穴的分子印跡電極（MIP／GCE）.

非印跡膜對(duì)照電極（NIP／GCE）的制備.除電沉積液中不含模板分子外，其他制備過程及條件與印跡電極的制備相同.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 電化學(xué)方法 以0.1mol·L-1，pH值為6.0的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）為支持電解質(zhì)，采用微分脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行掃描，考察工作電極在1.0×10-5mol·L-1L-Tyr溶液中的電化學(xué)響應(yīng).電位掃描范圍為0.4～1.0V，掃描速度為50mV·s-1，脈沖幅度為0.05V，脈沖周期為0.02s，脈沖寬度0.05s，靈敏度為1.0×10-6.記錄L-Tyr在工作電極上的氧化峰峰電流與電位的關(guān)系曲線.

電化學(xué)阻抗譜（EIS）實(shí)驗(yàn)是在含有5mmol·L-1［Fe（CN）6］3-／4-電化學(xué)探針的0.1mol·L-1KCl溶液中進(jìn)行，頻率范圍為1×10-2～1×105Hz.

1.3.2 掃描電鏡表征 將CTS，L-TyrNIP和L-TyrMIP分別電沉積于金片基底表面后，真空干燥48h.在加速電壓為5.0kV下，通過S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM）觀察各樣品的表面形貌.

2 結(jié)果與討論

2.1 L-Tyr在復(fù)合膜修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中酪氨酸分子能與殼聚糖一同沉積至電極表面并經(jīng)DPV掃描溶出，考察CTS-Tyr復(fù)合膜修飾電極與CTS修飾電極在0.1mol·L-1，pH值為6.0的PBS溶液中的DPV響應(yīng)，結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：相對(duì)于CTS／GCE的DPV曲線，CTS-Tyr／GCE的DPV曲線在0.762V處有一個(gè)較強(qiáng)的酪氨酸特征氧化峰；而內(nèi)插圖為MIP／GCE在含1.0×10-5mol·L-1L-Tyr溶液中DPV曲線，酪氨酸的氧化峰出現(xiàn)在0.720V.兩者氧化峰電位基本一致，可確定酪氨酸分子可與殼聚糖共同沉積至電極表面，并能通過DPV檢測(cè)出來.同時(shí)，溶液中的酪氨酸氧化峰電位較之膜上的負(fù)移了42mV，可知印跡電極表面印跡位點(diǎn)的存在更有利于L-Tyr在電極表面的氧化.

圖1 不同修飾電極的DPV電化學(xué)響應(yīng)Fig.1 DPVs of different modified electrodes

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1 電沉積時(shí)間的選擇 電沉積時(shí)間不同，則印跡膜厚度不同，膜厚度隨沉積時(shí)間增加而變大.不導(dǎo)電的印跡膜越薄，目標(biāo)分子通過界面的電荷轉(zhuǎn)移阻礙越小，則其對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的響應(yīng)越靈敏；印跡膜越厚，雖然靈敏度下降，但是其膜上印跡位點(diǎn)增加，印跡膜對(duì)目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合量也增加.采用恒電位沉積法，得到電沉積時(shí)間不同的印跡膜電極.根據(jù)洗脫模板分子后得到的印跡膜電極對(duì)同一濃度L-Tyr溶液的DPV響應(yīng)峰電流大小，來獲得最佳電沉積時(shí)間.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：電沉積時(shí)間小于100s時(shí)，隨沉積時(shí)間增加，響應(yīng)電流逐漸增加；沉積時(shí)間為100s時(shí)，響應(yīng)峰電流達(dá)到最大；而沉積時(shí)間大于100s時(shí)，由于圓盤電極表面積有限，膜太厚不利于膜中心L-Tyr的進(jìn)出，影響模板分子的完全洗脫及再次識(shí)別，所以響應(yīng)峰電流反而減少.因此，100s為最佳電沉積時(shí)間.

2.2.2 洗脫劑中無水乙醇含量的選擇 殼聚糖在水中溶脹度較大，顯著影響其分離選擇性能，因此必須先設(shè)法抑制其溶脹，維持其印跡空穴的剛性結(jié)構(gòu)［22］.研究表明：殼聚糖具有良好的耐有機(jī)溶劑（如乙醇）性能［23］，因此，采用調(diào)節(jié)洗脫劑中乙醇的體積分?jǐn)?shù)來調(diào)節(jié)殼聚糖膜的抗溶脹性能.為了選得最佳的洗脫劑，考察了0.01mol·L-1NaOH和不同體積分?jǐn)?shù)的無水乙醇作為洗脫劑時(shí)，印跡膜電極對(duì)同一濃度L-Tyr溶液的響應(yīng)峰電流（I）與第一次測(cè)定電流（I0）的百分比隨時(shí)間的變化.結(jié)果表明：當(dāng)洗脫劑中無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，酪氨酸的電化學(xué)響應(yīng)峰電流基本不變；而當(dāng)無水乙醇的體積分?jǐn)?shù)低于或超過0.5%時(shí)，響應(yīng)峰電流在一定程度上會(huì)隨著時(shí)間推移而增加或降低.由此可知，適量的乙醇增強(qiáng)了殼聚糖膜的致密性與穩(wěn)定性，有利于印跡膜微觀構(gòu)型的維持及印跡膜與目標(biāo)分子間相互作用的增強(qiáng).

2.2.3 洗脫時(shí)間的選擇 印跡電極的制備需經(jīng)電位誘導(dǎo)洗脫除去膜上的模板分子，留下能與酪氨酸特異性結(jié)合的印跡位點(diǎn).若洗脫時(shí)間太短，模板分子未完全洗脫，導(dǎo)致未洗脫掉的模板分子占據(jù)一定量的印跡位點(diǎn)，影響印跡膜電極對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的再次識(shí)別；若洗脫時(shí)間太長(zhǎng)，模板分子已完全洗脫，多余的電位誘導(dǎo)時(shí)間又會(huì)對(duì)膜的性質(zhì)帶來不必要的影響.因此，需選擇最佳洗脫時(shí)間.

洗脫時(shí)間對(duì)洗脫效果的影響，如圖2所示.由圖2可知：當(dāng)洗脫時(shí)間低于500s時(shí)，隨著洗脫時(shí)間增加，L-Tyr的DPV響應(yīng)峰電流逐步降低，但還是有信號(hào)殘留（曲線a～d），說明未能將L-Tyr從印跡膜上洗脫下來；當(dāng)洗脫時(shí)間達(dá)到500s后，電極在0.1mol·L-1pH 6.0PBS中的DPV曲線（曲線e）上基本沒有L-Tyr的特征峰，表明洗脫劑已將L-Tyr完全洗脫.后續(xù)試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，該印跡膜電極對(duì)L-Tyr的響應(yīng)穩(wěn)定.因此，認(rèn)為500s為最適宜的洗脫時(shí)間.

將三電極系統(tǒng)在含0.02mol·L-1L-Tyr的殼聚糖混合電沉積液中，于-1.1V恒電位下沉積100s，用少量二次水淋洗后晾干.然后，將制得的聚合膜修飾電極在+1.0V電位下，于0.01 mol·L-1NaOH和0.5%無水乙醇混合液中，恒電位洗脫500s，即制得對(duì)L-Tyr具有良好電化學(xué)響應(yīng)的酪氨酸分子印跡電極.

圖2 洗脫時(shí)間對(duì)洗脫效果的影響Fig.2 Impact of different elution time on the elution effect

2.3 酪氨酸分子印跡傳感器的修飾膜表征

2.3.1 SEM表征 采用SEM表征可得印跡膜的形貌及微觀結(jié)構(gòu)，如圖3所示.裸金電極表面呈平整剛性的結(jié)構(gòu)（圖3（a））；電沉積上CTS后，其表面可以觀察到致密的薄膜結(jié)構(gòu)（圖3（b），（c））；當(dāng)L-Tyr從復(fù)合物膜中洗脫后，印跡膜表面呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)（圖3（d）），有利于模板分子的進(jìn)出.

圖3 電極表面不同修飾膜的SEM圖Fig.3 SEM images of Au disk surface modified with different materials

2.3.2 EIS表征 采用EIS研究電極表面與溶液之間的電荷轉(zhuǎn)移，不同電極的交流阻抗圖譜如圖4所示.交流阻抗圖由預(yù)示膜阻抗的高頻區(qū)半圓（Rp）和溶液擴(kuò)散電阻的低頻區(qū)直線（Rs）組成.由圖4可知：裸電極（曲線a）的交流阻抗曲線近似為直線，表明此時(shí)［Fe（CN）6］3-／4-在裸電極上的反應(yīng)主要受溶液擴(kuò)散控制；當(dāng)電極表面電沉積上CTS（曲線c）以及CTS-Tyr復(fù)合物（曲線d）后，形成的復(fù)合物膜使［Fe（CN）6］3-／4-在電極界面的電荷轉(zhuǎn)移受阻，產(chǎn)生膜阻抗，Rp值分別增大至431.3，470.5Ω；而隨著酪氨酸的洗脫（曲線b），Rp降至304.2Ω，說明洗脫模板分子后，膜上留下的印跡空穴使得［Fe（CN）6］3-／4-到達(dá)電極表面變得容易.

圖4 不同電極的交流阻抗圖譜Fig.4 EIS of GCE modified with different material

2.4 酪氨酸分子印跡傳感器的特異識(shí)別性能

2.4.1 抗干擾性能 為了考察所制備的印跡電極抗其他共存物質(zhì)的干擾性能，參考了血清中幾種物質(zhì)的相對(duì)酪氨酸含量.模擬血清中各物質(zhì)的含量相對(duì)于酪氨酸含量的比率，如表1所示.測(cè)定了當(dāng)不同濃度倍數(shù)的共存物質(zhì)存在下，印跡電極對(duì)濃度為1.0×10-5mol·L-1L-Tyr的DPV響應(yīng)峰電流與不存在干擾時(shí)的峰電流比值（I／I0），如圖5所示.

由圖5可知：在遠(yuǎn)超過其理論相對(duì)含量的共存干擾存在下，所制得的印跡傳感器對(duì)同等濃度酪氨酸的電化學(xué)響應(yīng)峰電流變化在可接受的波動(dòng)范圍內(nèi).因此，該傳感器可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè).

表1 抗干擾實(shí)驗(yàn)溶液配制表Tab.1 Preparation of mixture solutions in the anti-interence experiment

圖5 不同干擾物存在時(shí)，印跡傳感器對(duì)酪氨酸的響應(yīng)電流變化Fig.5 I／I0of the MIP sensor for L-Tyr in the presence of dirrerent co-existing substances in blood serum

2.4.2 吸附等溫曲線研究及工作曲線 吸附等溫線是評(píng)價(jià)印跡膜親和性能的主要方法.為了模擬酪氨酸分子印跡電化學(xué)傳感器吸附酪氨酸分子的等溫吸附模型，參考Langmuir吸附模型［26］，提出一個(gè)適合本體系的擬合公式，即

式（1）中：Ip為分子印跡傳感器吸附達(dá)到平衡時(shí)，印跡膜上的的平衡吸附不同濃度酪氨酸時(shí)的響應(yīng)電流值，μA；c為吸附平衡時(shí)溶液中酪氨酸的濃度，μmol·L-1；Ipm為飽和吸附狀態(tài)下的響應(yīng)電流值，μA；k為吸附平衡解離常數(shù)，μmol·L-1.而印跡膜的印跡效果，可以用印跡因子IF表示，即IF＝Ipm（MIP）／Ipm（NIP）.IF越大，說明印跡膜的識(shí)別性強(qiáng)，印跡效果越好.

制備NIP和MIP兩種電化學(xué)傳感器，分別作其對(duì)L-Tyr的等溫吸附曲線，如圖6所示.由圖6（a）可知：L-Tyr在印跡傳感器上的DPV響應(yīng)明顯大于非印跡傳感器.表2為平衡吸附等溫曲線參數(shù)擬合表.從表2的擬合數(shù)據(jù)可知：飽和狀態(tài)下的響應(yīng)電流值MIP明顯大于NIP，IF可達(dá)3.34，表明印跡傳感器對(duì)酪氨酸具有較好的識(shí)別性能.

圖6 印跡與非印跡傳感器對(duì)酪氨酸分子的等溫吸附曲線Fig.6 Adsorption isotherm curves of L-Tyr on MIP and NIP sensors

解離常數(shù)k反映解離反應(yīng)的快慢，k越小說明解離越慢，解離程度越低，代表膜與分子之間的親和力越強(qiáng).表2中：印跡膜的k明顯小于非印跡膜的，同樣說明了印跡膜對(duì)L-Tyr特異性識(shí)別.

由圖6（b）可知：酪氨酸印跡傳感器對(duì)L-Tyr的響應(yīng)峰電流在4.0×10-7～1.0×10-4mol·L-1濃度范圍，呈現(xiàn)良好的線性變化，線性方程為Ip＝0.008 78c+0.003 52，R2＝0.999 1，定量檢出下限達(dá)2.0×10-7mol·L-1.

表2 平衡吸附等溫曲線參數(shù)擬合表Tab.2 Values of isotherm adsorption model parameters

2.5 重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

將所制備的酪氨酸分子印跡電極重復(fù)洗脫，測(cè)定其對(duì)1.0×10-5mol·L-1L-Tyr的電化學(xué)響應(yīng).結(jié)果表明：所得Ip的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%（n＝10），說明該傳感器重現(xiàn)性較好.每天使用一次該傳感器，連續(xù)使用一周后，Ip變化為初始值的99.76%，說明該電化學(xué)傳感器具有較好的穩(wěn)定性.

2.6 血清樣品分析及回收率的測(cè)定

自然界中的氨基酸和糖有左旋和右旋，但在生命體中，只有左旋的氨基酸和右旋的糖，即生命體中只有L-型氨基酸和D-型糖.

將印跡傳感器用于血清樣品中L-Tyr的測(cè)定，采用加標(biāo)回收法測(cè)回收率，結(jié)果如表3所示.表3中：cd為樣品測(cè)定值；ca為加入量；cf為測(cè)得量；η為回收率.由表3可知：MIP／GCE用于血清樣品中L-Tyr含量的測(cè)定，平均回收率在89.50%～99.67%之間.

表3 血清樣品中酪氨酸的測(cè)定Tab.3 Determination of the tyrosine in human serum samples

3 結(jié)束語

采用分子印跡技術(shù)，借助功能基體殼聚糖的電沉積制備了L-Tyr分子印跡電極，通過DPV法考察其對(duì)L-Tyr的響應(yīng)情況.在最佳制備條件下，所構(gòu)建的印跡膜傳感器對(duì)L-Tyr具有很好的靈敏度和特異識(shí)別性，同時(shí)也有較低的檢測(cè)限和較好的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性.印跡膜傳感器良好的抗干擾性能，使其成功地應(yīng)用于血清中L-Tyr的測(cè)定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：其在臨床診斷中，對(duì)血清酪氨酸的快捷、準(zhǔn)確檢測(cè)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.

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